Verlies-van-functie benadering in het embryonale kuiken netvlies door gebruik te maken van Tol2 transposon-gemedieerde transgene expressie van kunstmatige microRNA's
Summary
We hebben een nieuwe benadering van functieverlies ontwikkeld die de introductie en genomische integratie van kunstmatige micro-RNA-sequenties in kuikenembryo’s omvat door gebruik te maken van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem. Deze techniek biedt een robuuste en stabiele gen knockdown methodologie voor studies van de genfunctie tijdens de ontwikkeling.
Abstract
Het netvlies van het kuiken is al lang een belangrijk modelsysteem in de ontwikkelingsneurobiologie, met voordelen zoals de grote omvang, snelle ontwikkeling en toegankelijkheid voor visualisatie en experimentele manipulaties. De belangrijkste technische beperking was echter het gebrek aan robuuste benaderingen van functieverlies voor genfunctieanalyses. Dit protocol beschrijft een methodologie van gen-uitschakeling in het zich ontwikkelende netvlies van kuikens waarbij transgene expressie van kunstmatige microRNA’s (miRNA’s) plaatsvindt met behulp van het Tol2-transposonsysteem. In deze benadering wordt een Tol2-transposonplasmide dat een expressiecassette bevat voor de EmGFP-marker (smaragdgroen fluorescerend eiwit) en kunstmatige pre-miRNA-sequenties tegen een doelgen in het embryonale netvlies van het kuiken ingebracht met een Tol2-transposase-expressieconstruct door in ovo-elektroporatie . In de getransfecteerde retinale cellen katalyseert de transposase de excisie van de expressiecassette van de transposonvector en de integratie ervan in gastheerchromosomen, wat leidt tot de stabiele expressie van miRNA’s en het EmGFP-eiwit. In onze vorige studie hebben we aangetoond dat de expressie van Nel, een glycoproteïne dat meerdere functies uitoefent in de neurale ontwikkeling, aanzienlijk kan worden onderdrukt in het zich ontwikkelende netvlies van het kuiken door deze techniek te gebruiken. Onze resultaten geven aan dat deze methodologie een stabiele en robuuste onderdrukking van genexpressie induceert en dus een efficiënte benadering van functieverlies biedt voor studies naar retinale ontwikkeling.
Introduction
Het netvlies van gewervelde dieren is een belangrijk modelsysteem voor het bestuderen van neurale ontwikkeling. Ondanks de perifere locatie is het netvlies anatomisch en ontwikkelingsgericht een uitbreiding van het centrale zenuwstelsel, en de oogzenuw, die bestaat uit axonen van retinale ganglioncellen, vertegenwoordigt een kanaal in het centrale zenuwstelsel. Het netvlies van het kuiken heeft aanzienlijke voordelen als een modelsysteem om het moleculaire mechanisme van neurale ontwikkeling te bestuderen: het is groot en ontwikkelt zich snel; het heeft structurele en functionele overeenkomsten met het menselijk netvlies; Het is zeer toegankelijk voor visualisatie en experimentele manipulaties. Moleculaire mechanismen van celproliferatie en -differentiatie, morfogenese en axonbegeleiding tijdens neurale ontwikkeling zijn uitgebreid bestudeerd met behulp van het netvlies van de kip.
Bij ovo is elektroporatie de afgelopen twee decennia met succes gebruikt om ectopische genen in cellen in het zich ontwikkelende kuikenembryo te introduceren. Deze techniek maakt het mogelijk om ontwikkelende cellen te labelen, het lot van cellen te traceren en celmigratie en axonkanalen te traceren, evenals ectopische genexpressie voor in vivo analyse van de genfunctie. De voorwaarden voor in ovo-elektroporatie voor efficiënte ectopische genexpressie in kuikenembryo’s zijn goed vastgesteld 1,2,3.
Ondanks deze voordelen was het ontbreken van een stabiele techniek voor functieverlies voor studies van de genfunctie een belangrijke technische beperking van het kuikenembryo. Terwijl kuikenembryo’s geëlektropoeerd met kleine interfererende RNA’s (siRNA’s)4 of expressievectoren voor korte haarspeld-RNA’s (shRNA’s)5 knockdown van het beoogde gen vertonen, is genonderdrukking in die benaderingen van voorbijgaande aard omdat de effecten verdwijnen zodra cellen de geïntroduceerde RNA’s of DNA’s verliezen. Een stabielere genonderdrukking kan worden bereikt door siRNA’s in kuikenembryo’s af te leveren door een RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor) retrovirussystem 6. De virale vector integreert in het gastheergenoom en de ectopische genen worden stabiel tot expressie gebracht. Het retrovirus kan echter alleen in het genoom van delende cellen integreren tijdens de mitotische (M) fase van de celcyclus, wat een beperking kan opleggen aan de ontwikkelingsstadia en/of celtypen waarvoor deze functieverliesbenadering kan worden toegepast. Bovendien lijkt de expressie van transgenen door RCAS langzamer en minder robuust dan die geïnduceerd door in ovo-elektroporatie 7.
Transposons zijn genetische elementen die van de ene locatie op het genoom naar de andere gaan. Het Tol2-element is een lid van de hAT-transponeerbare elementenfamilie en bevat een intern gen dat codeert voor een transposase dat de transposonreactie van het Tol2-element8 katalyseert. Wanneer een plasmidevector met een genexpressiecassette geflankeerd door de sequenties van het linker- en rechteruiteinde van de Tol2-elementen (respectievelijk 200 bp en 150 bp) wordt ingebracht in gewervelde cellen met een Tol2-transposase-expressieconstruct, wordt de expressiecassette uit het plasmide gesneden en geïntegreerd in het gastheergenoom, dat een stabiele expressie van het ectopische gen ondersteunt (figuur 1). Het is aangetoond dat het Tol2-transponeerbare element zeer efficiënt gentranspositie kan induceren bij verschillende gewervelde soorten, waaronder zebravissen9,10, kikkers 11, kuikens 12 en muizen 13, en dus een nuttige methode is voor transgenese en insertionele mutagenese. Het Tol2-transposonsysteem is met succes gebruikt voor voorwaardelijke knockdown van een doelgen door genomische integratie van siRNA dat wordt verwerkt uit lang dubbelstrengs RNA14.
Dit protocol beschrijft een verlies-van-functie benadering in het kuikenembryo waarbij kunstmatige microRNA’s (miRNA’s) worden geïntroduceerd door het Tol2 transposon systeem15,16. In deze benadering wordt een expressiecassette voor de EmGFP (smaragdgroen fluorescerend eiwit) marker en kunstmatige miRNA’s tegen een doelgen gekloond in een Tol2 transposon vector. Het Tol2-transposonconstruct wordt vervolgens in het embryonale netvlies van het kuiken ingebracht met een Tol2-transposase-expressieconstruct door in ovo-elektroporatie. In de getransfecteerde retinale cellen katalyseert de transposase de excisie van de expressiecassette van de transposonvector en de integratie ervan in gastheerchromosomen, wat leidt tot de stabiele expressie van miRNA’s en het EmGFP-eiwit. In onze eerdere studies hebben we met succes de expressie van Nel, een extracellulair glycoproteïne dat voornamelijk tot expressie komt in het zenuwstelsel, in het zich ontwikkelende netvlies van het kuiken neergehaald (zie Representatieve resultaten). Onze resultaten geven aan dat stabiele en efficiënte genonderdrukking kan worden bereikt in ovo door deze techniek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een gedetailleerde gids voor gen-uitschakeling in het zich ontwikkelende netvlies van kuikens door transgene expressie van kunstmatige miRNA’s met behulp van ovo-elektroporatie en het Tol2-transposonsysteem.
De volgende factoren zijn van cruciaal belang bij het succesvol uitvoeren van deze techniek. Ten eerste is het van cruciaal belang om miRNA-sequenties te gebruiken waarvan is bevestigd dat ze robuuste knockdown-effecten uitoefenen. Voordat u ze toepast voor <em…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De pT2K-CAGGS en pCAGGS-T2TP vectoren werden vriendelijk geleverd door respectievelijk Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) en Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). We danken Michael Berberoglu voor zijn cruciale lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) aan M.N.
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer’s activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. 발생학. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. 유전학. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. . iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021)
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
