זיהוי וניתוח אוטומטיים של אקסוציאטוזיס
Summary
פיתחנו תוכנת ראייה ממוחשבת אוטומטית לזיהוי אירועים אקסוציאטיים המסומנים על ידי בדיקות פלואורסצנטיות רגישות ל- pH. כאן, אנו מדגימים את השימוש בממשק משתמש גרפי ו- RStudio כדי לזהות אירועי היתוך, לנתח ולהציג פרמטרים spatiotemporal של היתוך, ולסווג אירועים למצבי היתוך נפרדים.
Abstract
מיקרוסקופיית Timelapse TIRF של GFP רגיש ל-pH (pHluorin) המצורפת לחלבוני SNARE ארסיים היא שיטה יעילה לדמיין אירועים אקסוציאטיים ארסיים בודדים בתרבית התאים. כדי לבצע זיהוי וניתוח יעילים ובלתי משוחדים של אירועים כאלה, פותחה ויושמה גישה מבוססת ראייה ממוחשבת ב- MATLAB. צינור הניתוח מורכב מפילוח תאים ומאלגוריתם זיהוי אירועים אקסוציאטיים. גישת הראייה הממוחשבת כוללת כלים לחקירת פרמטרים מרובים של אירועים בודדים, כולל מחצית החיים של דעיכה פלואורסצנטית ושיא ΔF/F, כמו גם ניתוח תאים שלמים של תדירות האקסוציאטוזיס. פרמטרים אלה ואחרים של היתוך משמשים בגישה סיווג להבחין מצבי היתוך נפרדים. כאן GUI שנבנה לאחרונה מבצע את צינור הניתוח מתחילתו ועד סופו. עיבוד נוסף של פונקציית K של ריפלי ב- R Studio משמש להבחנה בין מופע מקובץ באשכולות, מפוזרים או אקראיים של אירועי היתוך הן במרחב והן בזמן.
Introduction
מבנים VAMP-pHluorin או קולטן העברה (TfR)-pHuji מבנים הם סמנים מצוינים של אירועים אקסוציאטיים, כמו אלה פלואורופורים רגישים pH מרווים בתוך לומן ארסית חומצה פלואורסצ’ה מיד עם פתיחת נקבובית היתוך בין קרום הלסת ופלזמה1. לאחר פתיחת נקבוביות היתוך, פלואורסצנטיות מתפורר באופן אקספוננציאלי, עם קצת הטרוגניות החושפת מידע על אירוע ההיתוך. כאן, מתואר יישום ממשק משתמש גרפי (GUI) המזהה ומנתח באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים. יישום זה מאפשר למשתמש לזהות באופן אוטומטי אירועים אקסוציאטיים שנחשפו על ידי סמנים רגישים ל- pH2 וליצור תכונות מכל אירוע שניתן להשתמש בה למטרות סיווג3 (איור 1A). בנוסף, מתואר ניתוח של קיבוץ אירועים אקסוציאטיים באמצעות הפונקציה K של ריפלי.
הסיווג האוטומטי של אירועים אקסוציאטיים למצבים אקסוציאטיים שונים דווח לאחרונה3. שני מצבים של אקסוציאטוזיס, היתוך ארסיה מלאה (FVF) ואקוציאציה של נשיקה וריצה (KNR) תוארו בעבר4,5,6,7. במהלך FVF, נקבובית ההיתוך מתרחבת, ואת ההדבקה משולבת לתוך קרום הפלזמה. במהלך KNR, נקבובית ההיתוך נפתחת באופן ארעי ולאחר מכן חותם מחדש4,5,8,9,10. ארבעה מצבים של אקסוציאטוזיס זוהו בפיתוח נוירונים, שניים הקשורים FVF ושניים הקשורים KNR. עבודה זו מדגימה כי הן FVF והן KNR ניתן לחלק עוד לאירועי היתוך הממשיכים מיד לריקבון פלואורסצנטיות (FVFi ו- KNRi) לאחר פתיחת נקבוביות היתוך או אירועים אקסוציטיים המציגים עיכוב לאחר פתיחת נקבובית היתוך לפני תחילת דעיכה פלואורסצנטית (FVFd ו- KNRd) (איור 1B). המסווג מזהה את מצב האקסוציאטוזיס עבור כל אירוע היתוך. כאן ניתוח זה שולב ב- GUI שניתן להתקין ב- MATLAB במערכות הפעלה מבוססות Windows ו- Mac. ניתן למצוא את כל קבצי הניתוח https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing או
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעת שימוש בתוכנת הזיהוי והניתוח האקסוציאטית, שקול שהתוכנית מקבלת דחיסה ללא אובדן נתונים בלבד .tif קבצים כקלט. קבצי התמונה .tif עשויים להיות תמונות בגווני אפור של 8 סיביות, 16 סיביות או 32 סיביות (ערוץ יחיד). יש להמיר תבניות תמונה אחרות לאחד מסוגים אלה לפני הקלט. לעיון, דוגמאות המשמשות כאן הן תמונו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדסטין רבל ורג’ינלד אדוארדס על בדיקת הקוד וה-GUI. המימון ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות נתמך מחקר זה: כולל R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) ו F31NS103586 (שפעת).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
