Automatiserad detektion och analys av exocytos
Summary
Vi utvecklade automatiserad datorseende programvara för att upptäcka exocytic händelser markerade med pH-känsliga fluorescerande sonder. Här demonstrerar vi användningen av ett grafiskt användargränssnitt och RStudio för att upptäcka fusionshändelser, analysera och visa spatiotemporala parametrar för fusion och klassificera händelser i distinkta fusionslägen.
Abstract
Timelapse TIRF mikroskopi av pH-känsliga GFP (pHluorin) fäst vid vesikel SNARE proteiner är en effektiv metod för att visualisera enskilda vesikel exocytic händelser i cellkulturen. För att utföra en opartisk, effektiv identifiering och analys av sådana händelser utvecklades och implementerades ett datorseendebaserat tillvägagångssätt i MATLAB. Analyspipelinen består av en cellsegmenterings- och exocytisk händelseidentifieringsalgoritm. Metoden med datorseende innehåller verktyg för att undersöka flera parametrar för enskilda händelser, inklusive halveringstiden för fluorescensförfall och topp ΔF/F, samt helcellsanalys av frekvensen av exocytos. Dessa och andra fusionsparametrar används i en klassificeringsmetod för att skilja distinkta fusionslägen. Här utför ett nybyggt GUI analyspipelinen från början till slut. Ytterligare anpassning av Ripleys K-funktion i R Studio används för att skilja mellan grupperade, spridda eller slumpmässiga förekomster av fusionshändelser i både tid och rum.
Introduction
VAMP-pHluorin konstruktioner eller transferrin receptor (TfR)-pHuji konstruktioner är utmärkta markörer för exocytic händelser, eftersom dessa pH-känsliga fluorforer släcks inom syra vesikel lumen och fluoresce omedelbart vid fusion por öppning mellan vesikel och plasmamembran 1. Efter fusion por öppning sönderfaller fluorescens exponentiellt, med viss heterogenitet som avslöjar information om fusionshändelsen. Här beskrivs ett grafiskt GUI-program (User Interface) som automatiskt identifierar och analyserar exocytiska händelser. Denna applikation gör det möjligt för användaren att automatiskt upptäcka exocytiska händelser som avslöjas av pH-känsligamarkörer 2 och generera funktioner från varje händelse som kan användas förklassificeringsändamål 3 (figur 1A). Dessutom beskrivs analys av exocytic händelse kluster med Ripleys K funktion.
Den automatiserade klassificeringen av exocytic händelser i olika exocytic lägen rapporterades nyligen3. Två lägen av exocytos, full vesikel fusion (FVF) och kyss-och-kör fusion (KNR) exocytos har tidigare beskrivits4,5,6,7. Under FVF vidgas fusionsporen och vesikeln införlivas i plasmamembranet. Under KNR öppnas fusionsporen tillfälligt och återförsluter sedan4,5,8,9,10. Fyra lägen av exocytos identifierades i utveckla nervceller, två relaterade till FVF och två relaterade till KNR. Detta arbete visar att både FVF och KNR kan delas in ytterligare i fusionshändelser som omedelbart fortsätter till fluorescensförfall (FVFi och KNRi) efter fusionsporöppning eller exocytiska händelser som uppvisar en fördröjning efter fusionsporöppning innan fluorescensförfall börjar (FVFd och KNRd) (Figur 1B). Klassificeraren identifierar exocytosläget för varje fusionshändelse. Här har denna analys införlivats i ett GUI som kan installeras i MATLAB i Windows och Mac baserade operativsystem. Alla analysfiler finns i https://drive.google.com/drive/folders/1VCiO-thMEd4jz-tYEL8I4N1Rf_zjnOgB?usp=sharing eller
https://github.com/GuptonLab.
Protocol
Representative Results
Discussion
När du använder exocytic detekterings- och analysprogramvaran, vänligen tänk på att programmet endast accepterar förlustfri komprimering .tif filer som indata. De .tif bildfilerna kan vara 8-bitars, 16- eller 32-bitars gråskalebilder (en kanal). Andra bildformat måste konverteras till någon av dessa typer innan de matas in. Som referens är exempel som används här 16-bitars gråskalebilder.
Som en naturlig del av den automatiska identifieringsprocessen bearbetas timelapse-bilduppsä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dustin Revell och Reginald Edwards för testkoden och GUI. Finansiering tillhandahölls av National Institutes of Health stödde denna forskning: inklusive R01NS112326 (SLG), R35GM135160 (SLG) och F31NS103586 (FLU).
Materials
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| R | R Core Team | https://www.r-project.org/ | |
| Rstudio | Rstudio, PBC | https://rstudio.com/ |
References
- Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217 (3), 1113-1128 (2018).
- Urbina, F. L., et al. TRIM67 regulates exocytic mode and neuronal morphogenesis via SNAP47. Cell Reports. 34 (6), 108743 (2021).
- Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: Role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Annual Review of Physiology. 75, 393-422 (2013).
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
- He, L., Wu, L. G. The debate on the kiss-and-run fusion at synapses. Trends in Neuroscience. 30 (9), 447-455 (2007).
- Elhamdani, A., Azizi, F., Artalejo, C. R. Double patch clamp reveals that transient fusion (kiss-and-run) is a major mechanism of secretion in calf adrenal chromaffin cells: high calcium shifts the mechanism from kiss-and-run to complete fusion. Journal of Neuroscience. 26 (11), 3030 (2006).
- Bowser, D. N., Khakh, B. S. Two forms of single-vesicle astrocyte exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (10), 4212-4217 (2007).
- Holroyd, P., Lang, T., Wenzel, D., De Camilli, P., Jahn, R. Imaging direct, dynamin-dependent recapture of fusing secretory granules on plasma membrane lawns from PC12 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16806-16811 (2002).
- Wang, C. T., et al. Different domains of synaptotagmin control the choice between kiss-and-run and full fusion. Nature. 424 (6951), 943-947 (2003).
- Winkle, C. C., Hanlin, C. C., Gupton, S. L. Utilizing combined methodologies to define the role of plasma membrane delivery during axon branching and neuronal morphogenesis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53743 (2016).
- Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373 (2011).
- Plooster, M., et al. TRIM9-dependent ubiquitination of DCC constrains kinase signaling, exocytosis, and axon branching. Molecular Biology of the Cell. 28 (18), 2374-2385 (2017).
- Urbina, F. L., Gupton, S. L. SNARE-mediated exocytosis in neuronal development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 133 (2020).
- Ripley, B. D. The second-order analysis of stationary point processes. Journal of Applied Probability. 13 (2), 255-266 (1976).
- Liu, A., et al. pHmScarlet is a pH-sensitive red fluorescent protein to monitor exocytosis docking and fusion steps. Nature Communication. 12 (1), 1413 (2021).
