प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई का उपयोग करके ताजा जमे हुए प्रांतस्था से वयस्क मानव एस्ट्रोसाइट आबादी का अलगाव
Summary
हमने एक ऐसी विधि विकसित की है जो डाउनस्ट्रीम आणविक विश्लेषण में उपयोग के लिए ताजा जमे हुए ऊतक से मानव एस्ट्रोसाइट आबादी को समृद्ध और अलग करती है।
Abstract
मानव एस्ट्रोसाइट्स की जटिलता प्राथमिक मानव ऊतक में खराब रूप से परिभाषित रहती है, जिसके लिए उनके अलगाव और आणविक लक्षण वर्णन के लिए बेहतर उपकरण की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छँटाई (एफएएनएस) का उपयोग जमे हुए अभिलेखीय ऊतक से मानव न्यूरोनल नाभिक (न्यूएन +) आबादी को सफलतापूर्वक अलग करने और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जिससे ताजा ऊतक को संभालने से जुड़ी समस्याओं से बचा जा सकता है। हालांकि, गैर-न्यूरोनल (न्यूएन-) तत्व से एस्ट्रोग्लिया को इसी तरह अलग करने के प्रयासों की कमी है। हाल ही में विकसित और मान्य इम्यूनोटैगिंग रणनीति तीन प्रतिलेखन कारक एंटीबॉडी का उपयोग एक साथ समृद्ध न्यूरोनल (न्यूएन +), एस्ट्रोसाइट (युग्मित बॉक्स प्रोटीन 6 (पीएएक्स 6) + न्यूएन-), और ओलिगोडेंड्रोसाइट पूर्वज (ओएलआईजी 2 + न्यूएन-) नाभिक आबादी को गैर-रोगग्रस्त, ताजा (अनफिक्स्ड) स्नैप-फ्रोजन पोस्टमॉर्टम मानव लौकिक नियोकॉर्टेक्स ऊतक से अलग करने के लिए करती है।
इस तकनीक को प्राथमिक पैथोलॉजिकल मिर्गी नियोकॉर्टेक्स में सेल प्रकार-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोम परिवर्तनों के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी दिखाया गया था। ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण ने पुष्टि की कि पीएएक्स 6 + न्यूएन- सॉर्ट की गई आबादी पैन-एस्ट्रोसाइट मार्करों के लिए मजबूती से समृद्ध है और आराम और प्रतिक्रियाशील दोनों स्थितियों में एस्ट्रोसाइट्स को पकड़ती है। यह पत्र ताजा जमे हुए मानव प्रांतस्था से एस्ट्रोसाइट-समृद्ध नाभिक आबादी के अलगाव के लिए प्रशंसकों की पद्धति का वर्णन करता है, जिसमें एकल-नाभिक (एसएन) निलंबन में ऊतक पृथक्करण शामिल है; एंटी-न्यूएन और एंटी-पैक्स 6 फ्लोरोसेंटली संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ नाभिक का इम्यूनोटैगिंग; सॉर्टिंग के दौरान संवेदनशीलता और विशिष्टता को अनुकूलित करने और एस्ट्रोसाइट संवर्धन की पुष्टि करने के लिए प्रशंसकों गेटिंग रणनीतियों और गुणवत्ता नियंत्रण मैट्रिक्स; और थोक या एसएन रिज़ॉल्यूशन पर डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्टोम और क्रोमैटिन एक्सेसिबिलिटी सीक्वेंसिंग के लिए खरीद की सिफारिश की। यह प्रोटोकॉल विभिन्न विकृतियों के साथ गैर-नेक्रोटिक, ताजा-जमे हुए, मानव कॉर्टिकल नमूनों के लिए लागू होता है और 24 घंटे के भीतर पोस्टमॉर्टम ऊतक संग्रह की सिफारिश की जाती है।
Introduction
मानव एस्ट्रोसाइट्स की आणविक जटिलता प्राथमिक ऊतक में खराब रूप से परिभाषित रहती है, स्वास्थ्य और बीमारी दोनों में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर उनके अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए बेहतर उपकरण की आवश्यकता होती है। अपने आला से बरकरार मानव न्यूरॉन्स और ग्लिया का पृथक्करण ताजा मस्तिष्क ऊतक के नमूनों की सीमित पहुंच, ग्लियाल और न्यूरोनल प्रक्रियाओं की भारी परस्पर प्रकृति और प्रसंस्करण के दौरान अपरिहार्य सेलुलर सक्रियण के कारण मुश्किल साबित हुआ है, जिनमें से सभी इन सेल प्रकारों के आणविक लक्षण वर्णन को सीमित करते हैं पूर्व विवो1 . प्रतिदीप्ति-सक्रिय नाभिक छंटाई (एफएएनएस) लाइव-सेल सॉर्टिंग के विकल्प के रूप में उभरा है, जो जमे हुए ऊतक से नाभिक आबादी के पृथक्करण और इम्यूनोटैगिंग को सक्षम करता है। पिछले एक दशक में, एफएएनएस का व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार के मस्तिष्क के नमूनों और शारीरिक क्षेत्रों 1,2,3,4 में मानव न्यूरोनल (न्यूएन +) नाभिक आबादी को अलग करने और आणविक रूप से चिह्नित करने के लिए उपयोग किया जाता है।
हालांकि, मानव प्रांतस्था से विशिष्ट ग्लियाल नाभिक उप-जनसंख्या को अलग करने के लिए समान तरीके सीमित हैं, जिससे सामान्य और रोगग्रस्त ऊतकों दोनों में एस्ट्रोसाइट जटिलता की समझ में परिष्कार की सापेक्ष कमी हो गई है। यह अंत करने के लिए, एक पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को एफएएनएस4 का उपयोग करके मानव न्यूरोनल आबादी को अलग करने के लिए अनुकूलित किया गया था, और ट्रिपल-एंटीबॉडी संयोजन का उपयोग करके एस्ट्रोसाइट्स (और ऑलिगोडेंड्रोग्लियल पूर्वजों के लिए) के लिए समृद्ध करने के लिए एक विधि को मान्य किया गया था, आराम और प्रतिक्रियाशील दोनों स्थितियों में एस्ट्रोसाइट्स पर कब्जा करना5. न्यूएन-अंश में एस्ट्रोसाइट्स के लिए विशेष रूप से समृद्ध करने के लिए, एंटीबॉडी का उपयोग दो प्रतिलेखन कारकों में से एक के खिलाफ किया गया था, जिन्हें एस्ट्रोसाइट आबादी, पीएएक्स 6 या एसआरवाई-बॉक्स प्रतिलेखन कारक 9 (एसओएक्स 9) 6,7 में अलग-अलग व्यक्त किया जाता था। पीएएक्स 6 रोगाणु क्षेत्रों में रेडियल ग्लिया जैसे पूर्वजों के भीतर प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान अत्यधिक व्यक्त किया जाता है और न्यूरोजेनेसिस औरग्लियोजेनेसिस 8,9,10,11 के साथ-साथ रेटिना न्यूरोनल विनिर्देश12 दोनों की ओर योगदान देता है। वयस्क में, पीएएक्स 6 को मानव एस्ट्रोसाइट्स6 को आराम करने में अलग-अलग अतिरंजित किया जाता है और मानव मिर्गी ऊतक एस्ट्रोसाइट्स13 में ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) के साथ प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति दिखाता है।
यह प्रोटोकॉल प्रशंसकों द्वारा नियोकोर्टिकल न्यूरोनल और एस्ट्रोसाइट-समृद्ध नाभिक आबादी के एक साथ अलगाव का वर्णन करता है। वयस्क प्रांतस्था से एकत्र ताजा (अनफिक्स्ड) स्नैप-फ्रोजन (यानी, ताजा-जमे हुए) पोस्टमॉर्टम ऊतक पहले यांत्रिक और रासायनिक रूप से अलग हो जाते हैं। सुक्रोज ढाल में लिसिस और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, साइटोप्लाज्मिक और बाह्य घटकों को त्याग दिया जाता है जबकि नाभिक को बनाए रखा जाता है। नाभिक को तब वांछित लक्ष्य वंशों के अनुरूप फ्लोरोसेंटली संयुग्मित परमाणु एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है और प्रशंसकों का उपयोग करके क्रमबद्ध किया जाता है। इस दृष्टिकोण के बाद, एस्ट्रोसाइट्स के संवर्धन को एकत्रित पैक्स 6 + न्यूएन- आबादी में प्रदर्शित किया जाता है, जो लक्षित क्यूपीसीआर पैनल के साथ-साथ डाउनस्ट्रीम परमाणु आरएनए अनुक्रमण दोनों द्वारा मान्य है।
Protocol
Representative Results
Discussion
उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद प्रायोगिक डिजाइन को कई जैविक और तकनीकी कारकों पर विचार करने के बाद अंतिम रूप दिया जाना चाहिए। ऊतक के नमूने शुरू करने से ताजा जमे हुए होते हैं, बिना तय किए, और अधिमानतः नाभिक वस?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम विशेषज्ञ सलाह के लिए डी-पहचाने गए मस्तिष्क के ऊतकों और आईएसएमएमएस के फ्लो साइटोमेट्री कोर की खरीद में मदद के लिए माउंट सिनाई में इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन में पैथोलॉजी और न्यूरोसर्जरी में सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। अध्ययन आंशिक रूप से एनआईएच आरएफ 1 डीए 048810, आर 01 एनएस 106229, आर 03 एनएस 101581 (एनएमटी के लिए), और आर 61 डीए 048207 (एसए के लिए) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
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