Isolering av voksne menneskelige astrocyttpopulasjoner fra ferskfrossen cortex ved hjelp av fluorescensaktivert nuklei-sortering
Summary
Vi har utviklet en metode som beriker og isolerer menneskelige astrocyttpopulasjoner fra ferskfrosset vev til bruk i nedstrøms molekylære analyser.
Abstract
Kompleksiteten til menneskelige astrocytter forblir dårlig definert i primært menneskelig vev, og krever bedre verktøy for isolasjon og molekylær karakterisering. Fluorescensaktivert nuklei sortering (FANS) kan brukes til å isolere og studere menneskelige nevronale kjerner (NeuN +) populasjoner fra frossent arkivvev, og dermed unngå problemer forbundet med håndtering av friskt vev. Imidlertid mangler innsats for å isolere astroglia fra det ikke-nevronale (NeuN-) elementet på samme måte. En nylig utviklet og validert immunotagging strategi bruker tre transkripsjon faktor antistoffer for samtidig å isolere beriket neuronal (NeuN +), astrocytt (parret boks protein 6 (PAX6)+NeuN-), og oligodendrocytt forfedre (OLIG2 +NeuN-) nuclei populasjoner fra ikke-syke, friske (unfixed) snap-frossen postmortem human temporal neocort vev.
Denne teknikken ble vist å være nyttig for karakterisering av celletypespesifikke transkripsjonsendringer i primær patologisk epilepsi neocortex. Transkripsjonsanalyser bekreftet at PAX6+NeuN-sorterte populasjoner er robust beriket for pan-astrocyttmarkører og fanger astrocytter under både hvilende og reaktive forhold. Dette dokumentet beskriver FANS-metodikken for isolering av astrocyttberikede kjerner fra ferskfrosset human cortex, inkludert vevsdissosiasjon til enkeltkjerne (sn) suspensjon; immunnagging av kjerner med anti-NeuN og anti-PAX6 fluorescerende konjugede antistoffer; FANS gating strategier og kvalitetskontroll beregninger for optimalisering følsomhet og spesifisitet under sortering og for å bekrefte astrocytt berikelse; anbefalte anskaffelser for nedstrøms transkripsjon og chromatin tilgjengelighet sekvensering ved bulk- eller sn-oppløsning. Denne protokollen gjelder for ikke-nekrotiske, ferskfryste, menneskelige kortikale prøver med ulike patologier og anbefalt postmortem vevsinnsamling innen 24 timer.
Introduction
Den molekylære kompleksiteten til menneskelige astrocytter forblir dårlig definert i primærvev, og krever bedre verktøy for isolasjon og karakterisering ved høy oppløsning, både i helse og sykdom. Separasjon av intakte menneskelige nevroner og glia fra deres nisje har vist seg vanskelig på grunn av begrenset tilgang til ferske hjernevevsprøver, den sterkt sammenkoblede naturen til glial- og nevronale prosesser, og uunngåelig cellulær aktivering under behandling, som alle begrenser molekylær karakterisering av disse celletypene ex vivo1 . Fluorescensaktivert nuklei sortering (FANS) har dukket opp som et alternativ til levende celle sortering, slik at dissosiasjon og immunotagging av kjerner populasjoner fra frossent vev. I løpet av det siste tiåret har FANS blitt mye brukt til å isolere og molekylært karakterisere menneskelige nevronale (NeuN +) kjernepopulasjoner i en rekke hjerneprøver og anatomiske regioner 1,2,3,4.
Imidlertid har lignende metoder for å isolere spesifikke glial nuklei subpopulations fra human cortex vært begrenset, noe som fører til en relativ mangel på raffinement i forståelsen av astrocyttkompleksitet i både normalt og sykt vev. For dette formål ble en tidligere publisert protokoll tilpasset for å isolere menneskelige nevronale populasjoner ved hjelp av FANS4, og en metode ble validert for å berike astrocytter (og for oligodendrogliale forfedre) ved hjelp av en trippel-antistoffkombinasjon, og fanget astrocytter i både hvilende og reaktive forhold5. For å spesifikt berike astrocytter i NeuN-fraksjonen ble antistoffer brukt mot en av to transkripsjonsfaktorer som er kjent for å være differensialt uttrykt på tvers av astrocyttpopulasjoner, PAX6 eller SRY-boks transkripsjonsfaktor 9 (SOX9)6,7. PAX6 er sterkt uttrykt under tidlig fosterutvikling innen radial glia-lignende forfedre i germinal soner og bidrar til både nevrogenese og gliogenese 8,9,10,11 samt til retinal neuronal spesifikasjon 12. Hos voksne er PAX6 differensialt overekspressert i hvilende menneskelige astrocytter6 og viser proteinkouttrykk med glial fibrillært surt protein (GFAP) i humant epilepsivev astrocytter13.
Denne protokollen beskriver samtidig isolasjon av neokortiske nevronale og astrocyttberikede nukleipopulasjoner av FANS. Fersk (uløst) snapfrossen (dvs. ferskfryst) postmortemvev samlet fra voksen cortex blir først mekanisk og kjemisk dissosiert. Etter lysis og ultracentrifugation i en sukrose gradient, blir de cytoplasmatiske og ekstracellulære komponentene kassert mens kjernene beholdes. Nuclei blir deretter merket med fluorescerende konjugerte kjernefysiske antistoffer som tilsvarer de ønskede mållinjeformene og sorteres ved hjelp av FANS. Etter denne tilnærmingen er berikelse av astrocytter demonstrert i de innsamlede PAX6 + NeuN-populasjonene, validert både av et målrettet qPCR-panel så vel som ved nedstrøms kjernefysisk RNA-sekvensering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksperimentell design etter den skisserte protokollen bør sluttføres etter å ha vurdert flere biologiske og tekniske faktorer. Startvevsprøver er ferskfryst, uten å ha blitt fikset, og har helst et kort postmortem samlingsintervall for å maksimere kjerner. Basert på erfaring gir en PMI på opptil 24 timer tilstrekkelig kjernegjenoppretting; En PMI på 12 timer eller mindre er imidlertid å foretrekke for å optimalisere intakt kjernegjenoppretting. Ytterligere faktorer bortsett fra PMI, inkludert temperatur på kr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi liker å takke medlemmer i patologi og nevrokirurgi ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai for hjelp med anskaffelsen av avidentifisert hjernevev og ISMMS’s Flow Cytometry CORE for ekspertråd. Studien ble delvis finansiert av NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (til N.M.T.) og R61DA048207 (til S.A.).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
