Isolierung von erwachsenen menschlichen Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenen Kortex mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung
Summary
Wir haben eine Methode entwickelt, die menschliche Astrozytenpopulationen aus frisch gefrorenem Gewebe anreichert und isoliert, um sie in nachgelagerten molekularen Analysen zu verwenden.
Abstract
Die Komplexität menschlicher Astrozyten ist im primären menschlichen Gewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und molekulare Charakterisierung. Die fluoreszenzaktivierte Nuclei Sorting (FANS) kann verwendet werden, um menschliche neuronale Kernpopulationen (NeuN +) erfolgreich aus gefrorenem Archivgewebe zu isolieren und zu untersuchen und so Probleme im Zusammenhang mit der Handhabung von frischem Gewebe zu vermeiden. Es fehlen jedoch Bemühungen, Astroglia in ähnlicher Weise vom nicht-neuronalen (NeuN-) Element zu isolieren. Eine kürzlich entwickelte und validierte Immunotagging-Strategie verwendet drei Transkriptionsfaktor-Antikörper, um gleichzeitig angereicherte neuronale (NeuN +), Astrozyten- (gepaart Boxprotein 6 (PAX6) + NeuN-) und Oligodendrozyten-Vorläufer- (OLIG2 + NeuN-) Kernpopulationen aus nicht erkranktem, frischem (nicht fixiertem) postmortalem humanem temporalem Neokortexgewebe zu isolieren.
Diese Technik erwies sich als nützlich für die Charakterisierung von zelltypspezifischen Transkriptomveränderungen im primären pathologischen Epilepsie-Neokortex. Transkriptomische Analysen bestätigten, dass PAX6+NeuN-sortierte Populationen robust für Pan-Astrozytenmarker angereichert sind und Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen einfangen. Dieses Papier beschreibt die FANS-Methodik zur Isolierung von Astrozyten-angereicherten Kernpopulationen aus frisch gefrorenen menschlichen Kortex, einschließlich der Gewebedissoziation in Einzelkernsussuspension (sn); Immuntagging von Kernen mit fluoreszenzkonjugierten Antikörpern gegen NeuN und PAX6; FANS Gating-Strategien und Qualitätskontrollmetriken zur Optimierung der Sensitivität und Spezifität während der Sortierung und zur Bestätigung der Astrozytenanreicherung; und empfohlene Beschaffung für die nachgelagerte Transkriptom- und Chromatin-Zugänglichkeitssequenzierung in Massen- oder SN-Auflösung. Dieses Protokoll gilt für nicht-nekrotische, frisch gefrorene, menschliche kortikale Proben mit verschiedenen Pathologien und empfohlener postmortaler Gewebeentnahme innerhalb von 24 h.
Introduction
Die molekulare Komplexität menschlicher Astrozyten ist im Primärgewebe nach wie vor schlecht definiert und erfordert bessere Werkzeuge für ihre Isolierung und Charakterisierung bei hoher Auflösung, sowohl im Gesundheits- als auch im Krankheitsbereich. Die Trennung intakter menschlicher Neuronen und Gliazellen von ihrer Nische hat sich aufgrund des begrenzten Zugangs zu frischen Hirngewebeproben, der stark miteinander verbundenen Natur von Glia- und neuronalen Prozessen und der unvermeidlichen zellulären Aktivierung während der Verarbeitung als schwierig erwiesen, die alle die molekulare Charakterisierung dieser Zelltypen ex vivoeinschränken 1 . Die fluoreszenzaktivierte Kernsortierung (FANS) hat sich als Alternative zur Lebendzellsortierung herauskristallisiert und ermöglicht die Dissoziation und Immuntagsierung von Kernpopulationen aus gefrorenem Gewebe. In den letzten zehn Jahren wurde FANS häufig zur Isolierung und molekularen Charakterisierung menschlicher neuronaler (NeuN +) Kernpopulationen in einer Vielzahl von Gehirnproben und anatomischen Regioneneingesetzt 1,2,3,4.
Ähnliche Methoden zur Isolierung spezifischer Gliakern-Subpopulationen aus dem menschlichen Kortex waren jedoch begrenzt, was zu einem relativen Mangel an Raffinesse beim Verständnis der Astrozytenkomplexität sowohl in normalem als auch in erkranktem Gewebe führte. Zu diesem Zweck wurde ein zuvor veröffentlichtes Protokoll zur Isolierung menschlicher neuronaler Populationen mit FANS4 angepasst und eine Methode zur Anreicherung für Astrozyten (und für oligodendrogliale Vorläufer) unter Verwendung einer Dreifach-Antikörper-Kombination validiert, wobei Astrozyten sowohl unter ruhenden als auch unter reaktiven Bedingungen erfasstwurden 5. Um speziell für Astrozyten in der NeuN-Fraktion anzureichern, wurden Antikörper gegen einen von zwei Transkriptionsfaktoren verwendet, von denen bekannt ist, dass sie über Astrozytenpopulationen hinweg unterschiedlich exprimiert werden, PAX6 oder SRY-Box-Transkriptionsfaktor 9 (SOX9) 6,7. PAX6 wird während der frühen fetalen Entwicklung in radialen gliaähnlichen Vorläufern in Keimzonen hoch exprimiert und trägt sowohl zur Neurogenese und Gliogenese 8,9,10,11 als auch zur retinalen neuronalen Spezifikation 12 bei. Beim Erwachsenen ist PAX6 in ruhenden menschlichen Astrozyten6 differentiell überexprimiert und zeigt eine Proteinkoexpression mit glialfibrillärem saurem Protein (GFAP) in humanen Epilepsiegewebeastrozyten13.
Dieses Protokoll beschreibt die gleichzeitige Isolierung neokortikaler neuronaler und astrozytenangereicherter Kernpopulationen durch FANS. Frisches (nicht fixiertes) schockgefrorenes (d.h. frisch gefrorenes) postmortales Gewebe, das aus dem erwachsenen Kortex entnommen wird, wird zunächst mechanisch und chemisch dissoziiert. Nach der Lyse und Ultrazentrifugation in einem Saccharosegradienten werden die zytoplasmatischen und extrazellulären Komponenten verworfen, während die Kerne erhalten bleiben. Die Kerne werden dann mit fluoreszierend konjugierten Kernantikörpern markiert, die den gewünschten Ziellinien entsprechen, und mit FANS sortiert. Nach diesem Ansatz wird die Anreicherung von Astrozyten in den gesammelten PAX6+NeuN-Populationen demonstriert, validiert sowohl durch ein gezieltes qPCR-Panel als auch durch nachgeschaltete nukleare RNA-Sequenzierung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das experimentelle Design nach dem skizzierten Protokoll sollte unter Berücksichtigung mehrerer biologischer und technischer Faktoren abgeschlossen werden. Beginnende Gewebeproben sind frisch gefroren, ohne fixiert worden zu sein, und haben vorzugsweise ein kurzes postmortales Entnahmeintervall, um die Kernerholung zu maximieren. Erfahrungsgemäß ermöglicht ein PMI von bis zu 24 h eine adäquate Kernerholung; Ein PMI von 12 h oder weniger ist jedoch vorzuziehen, um die Erholung intakter Kerne zu optimieren. Zusätzlic…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Mitgliedern der Pathologie und Neurochirurgie an der Icahn School of Medicine am Mount Sinai für ihre Hilfe bei der Beschaffung von de-identifiziertem Hirngewebe und der Durchflusszytometrie CORE von ISMMS für die fachkundige Beratung. Die Studie wurde teilweise von NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (zu N.M.T.) und R61DA048207 (zu S.A.) finanziert.
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
References
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