ניתן להשתמש במדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) בשילוב עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות כדי לצפות באגרגטים חיידקיים ברזולוציה גבוהה. מאמר זה מפרט שיטות להערכת אוכלוסיות מצטברות במהלך טיפול מיקרוביאלי כפלטפורמה למחקרים עתידיים.
פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא אחד הפתוגנים האופורטוניסטיים הנפוצים ביותר הקשורים סיסטיק פיברוזיס (CF). ברגע שהקולוניזציה של הרשות הפלסטינית נקבעת, חלק גדול מהחיידקים הנגועים יוצרים ביופילמים בתוך כיח דרכי הנשימה. Pa biofilms מבודד כיח CF הוכח לגדול אגרגטים קטנים, צפופים של ~ 10-1,000 תאים כי הם מאורגנים מרחבית ולהציג פנוטיפים רלוונטיים קלינית כגון סובלנות מיקרוביאלית. אחד האתגרים הגדולים ביותר בחקר האופן שבו אגרגטים של הרשות הפלסטינית מגיבים לסביבת הכיח המשתנה הוא היעדר מערכות רלוונטיות וחזקות מבחינה תזונתית המקדמות היווצרות מצטברת. באמצעות מדיום כיח CF סינתטי (SCFM2), ניתן לראות את היסטוריית החיים של אגרגטים Pa באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר confocal (CLSM) וניתוח תמונה ברזולוציה של תא אחד. מערכת במבחנה זו מאפשרת התבוננות באלפי אגרגטים בגדלים משתנים בזמן אמת, בשלושה ממדים ובקנה מידה מיקרון. ברמות הפרט והאוכלוסייה, היכולת לקבץ אגרגטים לפי פנוטיפ ומיקום מאפשרת תצפית של אגרגטים בשלבים התפתחותיים שונים ותגובתם לשינויים במיקרו-סביבה, כגון טיפול אנטיביוטי, יובדלו בדיוק.
פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא פתוגן אופורטוניסטי המבסס זיהומים כרוניים אצל אנשים שנפגעו ממערכת החיסון. עבור אלה עם המחלה הגנטית סיסטיק פיברוזיס (CF), זיהומים אלה יכולים להתפרש במהלך החיים. CF גורם להצטברות של כיח צמיג, עשיר בחומרים מזינים בדרכי הנשימה, אשר הופך קולוניאלי על ידי מגוון רחב של פתוגנים מיקרוביאליים לאורך זמן. Pa הוא אחד הפתוגנים הנפוצים ביותר CF, ליישב את דרכי הנשימה בגיל הרך ולהקים זיהומים קשים לטיפול1. הרשות הפלסטינית נותרהבעיהקלינית משמעותית ונחשבת לסיבה מובילה לתמותה אצל בעלי CF, למרות משטרי טיפול משופרים בשנים האחרונות 2,3. פנוטיפ התמדה זה וסובלנות אנטיביוטית גוברת זיכו את אבא במקום בקבוצת פתוגנים שזוהו הן על ידי המרכז לבקרת מחלות (CDC) והן על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) כסדרי עדיפויות מחקריים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות – פתוגנים ESKAPE4.
כמו פתוגנים אחרים ESKAPE, עמידות לאנטיביוטיקה נרכשת נפוצה ברשות הפלסטינית, אבל יש גם תכונות מהותיות רבות התורמות Pa סובלנות מיקרוביאלית. בין אלה היא היכולת של הרשות הפלסטינית ליצור אשכולות צפופים מאוד של ~ 10-1,000 תאים, אשר ניתן לראות בזיהומים מרובים, כולל כיח חולה CF5,6. בדומה ל-Pa שנחקרה במערכות ביופילם אחרות, אגרגטים של הרשות מציגים פנוטיפים רלוונטיים קלינית כגון עמידות מוגברת לאנטיביוטיקה והפעלה של תקשורת תאית (חישת מניין (QS)). לדוגמה, אגרגטים של Pa הוכחו להשתמש בהתנהגויות מוסדר QS כדי להילחם חיידקים אחרים, כמו גם לסבול טיפולים מיקרוביאלית כגון הייצור של פיוצינין7. היכולת לחקור התנהגויות כאלה מציעה תובנה מרגשת על מערכות אקולוגיות חיידקיות בסביבה דומה לזו שבה הן קיימות בגוף האדם.
אחד האתגרים הגדולים ביותר בחקר האופן שבו אגרגטים של הרשות הפלסטינית מגיבים לסביבת הכיח המשתנה הוא היעדר מערכות רלוונטיות וחזקות מבחינה תזונתית המקדמות היווצרות מצטברת. הרבה ממה שידוע על אבא התגלה באמצעות מערכות במבחנה שבהן תאים גדלים פלנקטונית או בארכיטקטורה אופיינית המחוברת לפני השטח, “פטריות” שלא נצפתה ב- vivo8. בעוד שמודלים קלאסיים לצמיחה של ביופילם, כגון תאי זרימה או אגר מוצק, הניבו ידע נרחב ויקר ערך על התנהגויות חיידקים ומנגנונים של סובלנות אנטיביוטית, ממצאים אלה לא תמיד מתורגמים ב- vivo. מודלים במבחנה רבים יש יכולת מוגבלת לחקות את סביבת הצמיחה של אתר הזיהום האנושי, המחייב יקר במחקרים vivo. בתורו, דגמים רבים ב- vivo חסרים את הגמישות והרזולוציה המוענקות על ידי טכניקות במבחנה.
כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) נועד לספק סביבה לצמיחת Pa דומה לזו שחוו במהלך זיהום כרוני בריאת CF. SCFM2 כולל מקורות תזונתיים שזוהו CF סייחה צפויה בנוסף mucin, שומנים, ו- DNA. צמיחת הרשות הפלסטינית ב- SCFM2 דורשת גן כמעט זהה לזה הנדרש לצמיחה בליחה בפועל ותומכת במבנה טבעי של הרשות הפלסטינית 9,10. לאחר החיסון, תאים פלנקטוניים יוצרים אגרגטים הגדלים בגודלם באמצעות התרחבות. תאים בודדים (המכונים מהגרים) משתחררים מצבירה, נודדים לאזורים לא נוסעים ויוצרים אגרגטים חדשים10. ניתן לצפות בהיסטוריית חיים זו באמצעות CLSM וניתוח תמונה ברזולוציה של תא בודד. אגרגטים של Pa שנוצר ב- SCFM2 הם בגדלים דומים לאלה שנצפו בריאת CF10. מודל זה מאפשר תצפית של אגרגטים מרובים בגודל משתנה בזמן אמת ובשלושה ממדים בקנה המידה המיקרוני. מיקרוסקופיה של זמן-לשגות מאפשרת מעקב אחר אלפי אגרגטים (כ-50,000) בניסוי אחד. השימוש בתוכנת ניתוח תמונה מאפשר כימות של פנוטיפים מצטברים ממיקרוגרפים, כולל נפח מצטבר, שטח פנים ומיקום בשלושה ממדים ל- 0.1 מיקרומטר הקרוב ביותר, הן במצטבר האישי והן ברמת האוכלוסייה. לאחר היכולת לקבץ אגרגטים לפי פנוטיפ ומיקום מאפשרת הבחנה של אגרגטים בשלבים התפתחותיים שונים עם דיוק, כמו גם את תגובתם microenvironment משתנה6,11.
היישום של SCFM2 ללמוד אגרגטים Pa בנפח נמוך ובוחות תפוקה גבוהה להפוך אותו מודל גמיש, חסכוני. כמדיום מוגדר, SCFM2 מציע אחידות ושחזור על פני פלטפורמות מרובות, מתן שיטה רלוונטית מבחינה תזונתית ופיזית ללמוד אגרגטים Pa במבחנה9. היישומים כוללים את השימוש בו בשילוב עם CLSM כדי לבחון ארגון מרחבי וסובלנות אנטיביוטית ברזולוציה גבוהה (כמתואר בנייר שיטות זה). היכולת לבצע ניסויים המספקים נתונים בקנה מידה מיקרוני בזמן אמת מאפשרת לחקור אינטראקציות בין מינים ובין מינים כפי שהם עשויים להתרחש ב vivo. לדוגמה, SCFM2 שימש בעבר כדי ללמוד את הדינמיקה המרחבית של תקשורת תא-תאים באוכלוסיות צבירה באמצעות רשת של מערכות המשמשות את הרשות הפלסטינית כדי לווסת גנים מרובים התורמים virulence ופתוגנזה6.
איור 1: תיאור גרפי של השלבים הניסיוניים העיקריים. (A)SCFM2 מחוסן בתאי Pa ומותר ליצור אגרגטים בצלחת תרבות עם תחתית זכוכית. (B)אגרגטים מועברים למיקרוסקופ הקונפוקלי, ומתווסף אנטיביוטיקה. מתוארים שלושה העתקים טכניים (תאים 1-3) ובאר שליטה (4) של SCFM2 מחוסן ללא טיפול אנטיביוטי. אגרגטים מצולם באמצעות CLSM במהלך 18 שעות. (C) לאחר ההדמיה הראשונית של 18 שעות, אגרגטים מטופלים עם פרופיל יודיד כדי לדמיין תאים מתים ותמונה באמצעות CLSM (D)אגרגטים עם פנוטיפ הרצוי מופרדים SCFM2 באמצעות FACS. קיצורים: SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סינתטי כיח בינוני; Pa = פסאודומונס ארוגינוזה; CLSM = מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית; FACS = מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כאן, השירות של SCFM2 כדי לחקור את ההשפעה של טיפול אנטיביוטי על אגרגטים Pa בזמן אמת מוכח, ואחריו שימוש בגישה של מיון תאים כדי לבודד אוכלוסיות של אגרגטים עם פנוטיפים ברורים לניתוח במורד הזרם (איור 1).
עבודה זו הציגה מתודולוגיות שניתן לשלב כדי לחקור אוכלוסיות צבירה חיידקיות בנוכחות ובהיעדר טיפול אנטיביוטי. CLSM ברזולוציה גבוהה מאפשר הדמיה של שינויים ביומסה מצטברת ואת הכיוון המבני של אגרגטים על פני זמן אמת כאשר נחשף לאנטיביוטיקה. בנוסף, ניתן לכמת תכונות פיזיות ומבניות של הביומסה שנותרו ל…
The authors have nothing to disclose.
S.E.D נתמך על ידי קרנות סטארט-אפ המסופקות על ידי המחלקה לרפואה מולקולרית, אוניברסיטת דרום פלורידה, כמו גם מענק מחקר CFF (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 – 02 (PI, חן)) ומכון USF על מיקרוביום. אנו מודים למעבדת ויטלי על שיתוף הפעולה המתמשך הכולל ערכות נתונים הקשורות לכתב יד זה. אנו מודים לד”ר צ’ארלס סקרס על שטיפל במיון של FACS. דמויות נוצרו על ידי A.D.G וS.E.D. באמצעות Biorender.com.
Amino acids | |||
Alanine | Acr![]() |
56-41-7 | |
Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
Asparagine | Acr![]() |
56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
Glutamic acid HCl | Acr![]() |
138-15-8 | |
Glycine | Acr![]() |
56-40-6 | |
Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
Isoleucine | Acr![]() |
73-32-5 | |
Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
Methionine | Acr![]() |
63-68-3 | |
Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
Phenylalanine | Acr![]() |
63-91-2 | |
Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
Threonine | Acr![]() |
72-19-5 | |
Tryptophan | Acr![]() |
73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
Valine | Acr![]() |
72-18-4 | |
Antibiotic | |||
Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
Day-of Stocks | |||
CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
FeSO4 * 7H2O | Acr![]() |
7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
MgCl2 * 6H2O | Acr![]() |
7791-18-6 | |
N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
Prepared solids | |||
Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
Stain | |||
Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
Salts | |||
K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
KNO3 | Acr![]() |
7757-79-1 | |
MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
NH4Cl | Acr![]() |
12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
Consumables | |||
Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
Software | |||
Biorender | To prepare the figures | ||
FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
Zen Black | |||
Equipment | |||
FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |