Herramientas para la evaluación en tiempo real de un modelo de infección por Pseudomonas aeruginosa
Summary
El medio de esputo sintético para fibrosis quística (SCFM2) se puede utilizar en combinación con microscopía de barrido láser confocal y clasificación celular activada por fluorescencia para observar agregados bacterianos a alta resolución. Este documento detalla los métodos para evaluar las poblaciones agregadas durante el tratamiento antimicrobiano como plataforma para futuros estudios.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (Pa) es uno de los patógenos oportunistas más comunes asociados con la fibrosis quística (FQ). Una vez que se establece la colonización por Pa, una gran proporción de las bacterias infectantes forman biopelículas dentro del esputo de las vías respiratorias. Se ha demostrado que las biopelículas de Pa aisladas del esputo de FQ crecen en agregados pequeños y densos de ~ 10-1,000 células que están organizadas espacialmente y exhiben fenotipos clínicamente relevantes, como la tolerancia a los antimicrobianos. Uno de los mayores desafíos para estudiar cómo los agregados de Pa responden al entorno cambiante del esputo es la falta de sistemas nutricionalmente relevantes y robustos que promuevan la formación de agregados. Utilizando un medio sintético de esputo CF (SCFM2), se puede observar la historia de vida de los agregados de Pa utilizando microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) y análisis de imágenes a la resolución de una sola célula. Este sistema in vitro permite la observación de miles de agregados de tamaño variable en tiempo real, tres dimensiones y a escala de micras. A nivel individual y poblacional, tener la capacidad de agrupar agregados por fenotipo y posición facilita la observación de agregados en diferentes etapas de desarrollo y su respuesta a cambios en el microambiente, como el tratamiento antibiótico, para diferenciarlos con precisión.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa (Pa) es un patógeno oportunista que establece infecciones crónicas en individuos inmunocomprometidos. Para aquellos con la enfermedad genética fibrosis quística (FQ), estas infecciones pueden abarcar el curso de toda la vida. La FQ causa la acumulación de un esputo viscoso y rico en nutrientes en las vías respiratorias, que se coloniza por una variedad de patógenos microbianos con el tiempo. Pa es uno de los patógenos de la FQ más prevalentes, colonizando las vías respiratorias en la primera infancia y estableciendo infecciones difíciles de tratar1. La PA sigue siendo un problema clínico significativo y se considera una de las principales causas de mortalidad en las personas con FQ, a pesar de la mejora de los regímenes terapéuticos en los últimos años2,3. Este fenotipo de persistencia y el aumento de la tolerancia a los antibióticos le han valido a Pa un lugar en un grupo de patógenos identificados tanto por los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) como por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como prioridades de investigación para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas: los patógenos ESKAPE4.
Al igual que otros patógenos ESKAPE, la resistencia a los antibióticos adquirida es común en Pa,pero también hay muchas propiedades intrínsecas que contribuyen a la tolerancia antimicrobiana de Pa. Entre estos se encuentra la capacidad de Pa para formar agregados, grupos altamente densos de ~ 10-1,000 células, que se pueden observar en múltiples infecciones, incluido el esputo del paciente con FQ5,6. Al igual que el Pa estudiado en otros sistemas de biopelículas, los agregados de Pa muestran fenotipos clínicamente relevantes, como el aumento de la resistencia a los antibióticos y la activación de la comunicación célula-célula (detección de quórum (QS)). Por ejemplo, se ha demostrado que los agregados de Pa utilizan comportamientos regulados por QS para combatir otros microbios, así como tolerar tratamientos antimicrobianos como la producción de piocianina7. La capacidad de estudiar tales comportamientos ofrece una visión emocionante de los ecosistemas bacterianos en un entorno similar a aquel en el que existen en el cuerpo humano.
Uno de los mayores desafíos para estudiar cómo los agregados de Pa responden al entorno cambiante del esputo es la falta de sistemas nutricionalmente relevantes y robustos que promuevan la formación de agregados. Gran parte de lo que se sabe sobre Pa se ha descubierto utilizando sistemas in vitro en los que las células crecen planctonicamente o en una arquitectura característica de “hongo” unida a la superficie que no se ha observado in vivo8. Si bien los modelos clásicos de crecimiento de biopelículas, como las células de flujo o el agar sólido, han producido un conocimiento extenso y valioso sobre los comportamientos bacterianos y los mecanismos de tolerancia a los antibióticos, estos hallazgos no siempre se traducen in vivo. Muchos modelos in vitro tienen una capacidad limitada para imitar el entorno de crecimiento del sitio de infección humana, lo que requiere costosos estudios in vivo. A su vez, muchos modelos in vivo carecen de la flexibilidad y resolución que ofrecen las técnicas in vitro.
El esputo sintético de fibrosis quística (SCFM2) está diseñado para proporcionar un entorno para el crecimiento de Pa similar al experimentado durante la infección crónica en el pulmón de la FQ. SCFM2 incluye fuentes nutricionales identificadas en la sputa de FQ expectorada, además de mucina, lípidos y ADN. El crecimiento de Pa en SCFM2 requiere un conjunto de genes casi idéntico al requerido para el crecimiento en esputo real y apoya la formación natural de agregados de Pa 9,10. Después de la inoculación, las células planctónicas forman agregados que aumentan de tamaño a través de la expansión. Las células individuales (denominadas migrantes) se liberan de los agregados, migran a áreas no coloreadas y forman nuevos agregados10. Esta historia de vida se puede observar utilizando CLSM y análisis de imágenes a la resolución de una sola célula. Los agregados de Pa formados en SCFM2 son de tamaños similares a los observados en la FQ pulmonar10. Este modelo permite la observación de múltiples agregados de tamaño variable en tiempo real y en tres dimensiones a escala de micras. La microscopía de lapso de tiempo permite el seguimiento de miles (~ 50,000) de agregados en un experimento. El uso de software de análisis de imágenes permite la cuantificación de fenotipos agregados a partir de micrografías, incluido el volumen agregado, el área de superficie y la posición en tres dimensiones hasta los 0,1 μm más cercanos, tanto a nivel de agregado individual como de población. Tener la capacidad de agrupar agregados por fenotipo y posición permite la diferenciación de agregados en diferentes etapas de desarrollo con precisión, así como su respuesta a un microambiente cambiante6,11.
La aplicación de SCFM2 para estudiar agregados de Pa en ensayos de bajo volumen y alto rendimiento lo convierten en un modelo flexible y rentable. Como medio definido, SCFM2 ofrece uniformidad y reproducibilidad a través de múltiples plataformas, proporcionando un método nutricional y físicamente relevante para estudiar agregados de Pa in vitro9. Las aplicaciones incluyen su uso en combinación con CLSM para observar la organización espacial y la tolerancia a los antibióticos a alta resolución (como se describe en este documento de métodos). La capacidad de realizar experimentos que proporcionan datos en tiempo real a escala de micras permite el estudio de las interacciones intra-especie e inter-especie a medida que pueden ocurrir in vivo. Por ejemplo, SCFM2 se ha utilizado previamente para estudiar la dinámica espacial de la comunicación célula-célula en poblaciones agregadas a través de una red de sistemas utilizados por Pa para regular múltiples genes que contribuyen a la virulencia y patogénesis6.
Figura 1: Representación gráfica de los principales pasos experimentales. (A) SCFM2 se inocula con células Pa y se le permite formar agregados en un plato de cultivo con fondo de vidrio. (B) Los agregados se transfieren al microscopio confocal y se agrega antibiótico. Se representan tres réplicas técnicas (cámaras 1-3) y un pozo de control (4) de SCFM2 inoculado sin tratamiento antibiótico. Los agregados se visualizan utilizando CLSM en el transcurso de 18 h. (C) Después de la imagen inicial de 18 h, los agregados se tratan con yoduro de propidio para visualizar las células muertas y se visualizan utilizando CLSM (D) Los agregados con el fenotipo deseado se separan de SCFM2 utilizando FACS. Abreviaturas: SCFM2 = medio de esputo sintético de fibrosis quística; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopía de barrido láser confocal; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Aquí, se demuestra la utilidad de SCFM2 para estudiar el impacto del tratamiento antibiótico en los agregados de Pa en tiempo real, seguido por el uso de un enfoque de clasificación celular para aislar poblaciones de agregados con fenotipos distintos para el análisis posterior(Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabajo ha introducido metodologías que se pueden combinar para estudiar poblaciones agregadas bacterianas en presencia y ausencia de tratamiento antibiótico. El CLSM de alta resolución permite la visualización de los cambios en la biomasa agregada y la orientación estructural de los agregados en tiempo real cuando se exponen a antibióticos. Además, se pueden cuantificar las características físicas y estructurales de la biomasa que quedan después del tratamiento con antibióticos, con el objetivo de correl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.E.D cuenta con el apoyo de fondos iniciales proporcionados por el Departamento de Medicina Molecular de la Universidad del Sur de Florida, así como una subvención de investigación CFF (DARCH19G0), el N.I.H (5R21AI147654 – 02 (PI, Chen)) y el Instituto de Microbiomas de la USF. Agradecemos al laboratorio de Whiteley por la colaboración continua que involucra conjuntos de datos relacionados con este manuscrito. Agradecemos al Dr. Charles Szekeres por facilitar la clasificación de FACS. Las figuras fueron creadas por A.D.G y S.E.D utilizando Biorender.com.
Materials
| Amino acids | |||
| Alanine | Acr s Organics |
56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acrs Organics |
56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acrs Organics |
138-15-8 | |
| Glycine | Acrs Organics |
56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acrs Organics |
73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acrs Organics |
63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acrs Organics |
63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acrs Organics |
72-19-5 | |
| Tryptophan | Acrs Organics |
73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acrs Organics |
72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acrs Organics |
7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acrs Organics |
7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acrs Organics |
7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acrs Organics |
12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
- Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
- O’Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
- Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).
