Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi ile Birleştirilmiş Headspace Katı Faz Mikroextraction Kullanarak Frenk Üzümü Meyvesinde Uçucu Bileşiklerin Profillemesi
Summary
Olgun frenk üzümü meyvelerinde hızlı, güvenilir ve yarı otomatik uçucu tanımlama ve niceleme için burada bir headspace katı faz mikroextraction-gaz kromatografi platformu açıklanmıştır. Bu teknik, meyve aroması hakkındaki bilgileri artırmak ve üreme amacıyla gelişmiş lezzete sahip kültivarları seçmek için kullanılabilir.
Abstract
Gelişmiş organoleptik özelliklere sahip çeşitlerin veya kültivarların yetiştirilmesi amacıyla olgun meyvelerin yaydığı uçucu organik bileşiklerin (VOC’ ler) ölçülmesine ve böylece tüketici kabulünün artırılmasına yönelik artan bir ilgi vardır. Yüksek verimli metabolomik platformlar, meyve tadı ve aroma kalitesinden (volatilomics) sorumlu temel bileşikler de dahil olmak üzere farklı bitki dokularında çok çeşitli metabolitleri ölçmek için geliştirilmiştir. Tat ve sağlık yararları ile çok takdir edilen olgun frenk üzümü meyveleri tarafından yayılan VOC’lerin tanımlanması ve ölçülmesi için gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile birlikte headspace katı faz mikroextraction (HS-SPME) kullanan bir yöntem burada açıklanmıştır.
Frenk üzümü bitkilerinin olgun meyveleri (Ribes nigrum) hasat edildi ve doğrudan sıvı nitrojende donduruldu. İnce bir toz üretmek için doku homojenizasyonu yapıldıktan sonra, numuneler çözüldü ve hemen sodyum klorür çözeltisi ile karıştırıldı. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant sodyum klorür içeren bir kafa boşluğu cam şişesine aktarıldı. VOC’ler daha sonra bir katı fazlı mikroextraction (SPME) fiberi ve bir iyon kapan kütle spektrometresine bağlı bir gaz kromatografı kullanılarak çıkarıldı. Elde edilen iyon kromatogramlarında uçucu niceleme, her VOC için belirli bir m/z iyon kullanılarak, tepe alanını entegre ederek gerçekleştirildi. Doğru VOC ek açıklaması, numunelerle aynı koşullar altında çalışan saf ticari standartların tutma süreleri ve kütle spektrumları karşılaştırılarak doğrulandı. Avrupa’nın zıt yerlerinde yetişen olgun frenk üzümü meyvelerinde 60’tan fazla VOC tespit edildi. Tanımlanan VOC’ler arasında terpenoidler ve C6 uçucuları gibi temel aroma bileşikleri, frenk üzümü meyve kalitesi için biyobelirteç olarak kullanılabilir. Ek olarak, olası iyileştirmeler de dahil olmak üzere yöntemin avantajları ve dezavantajları tartışılmaktadır. Ayrıca, toplu düzeltme ve sürüklenme yoğunluğunun en aza indirilmesi için kontrollerin kullanımı vurgulanmıştır.
Introduction
Lezzet, herhangi bir meyve için temel bir kalite özelliğidir, tüketici kabullerini etkiler ve böylece pazarlanabilirliği önemli ölçüde etkiler. Lezzet algısı, tat ve koku alma sistemlerinin bir kombinasyonunu içerir ve kimyasal olarak yenilebilir bitki parçalarında biriken veya VOC’ler durumunda olgun meyve tarafından yayılan çok çeşitli bileşiklerin varlığına ve konsantrasyonuna bağlıdır1,2. Geleneksel ıslah verim ve haşere direnci gibi agronomik özelliklere odaklanırken, lezzet de dahil olmak üzere meyve kalitesi özelliği iyileştirmesi, genetik karmaşıklık ve bu özellikleri düzgün bir şekilde fenotipleme zorluğu nedeniyle uzun zamandır ihmal edilmiş ve tüketici hoşnutsuzluğuna yol almıştır3,4. Metabolomik platformlardaki son gelişmeler, meyve tadı ve aromadan sorumlu temel bileşikleri belirleme ve ölçmede başarılı olmuştur5,6,7,8. Ayrıca, metabolit profillemenin genomik veya transkriptomik araçlarla kombinasyonu, üreme programlarının gelişmiş organoleptik özelliklere sahip yeni çeşitler geliştirmesine yardımcı olacak temel meyve lezzetinin alaşım edilmesine izin verir2,4,9,10,11,12,13,14.
Frenk üzümü (Ribes nigrum) meyveleri, Avrupa, Asya ve Yeni Zelanda’nın ılıman bölgelerinde yaygın olarak yetiştirilen lezzet ve besin özellikleri ile çok takdir edilmektedir15. Üretimin çoğu, esas olarak meyvelerin organoleptik özellikleri nedeniyle İskandinav ülkelerinde çok popüler olan gıda ürünleri ve içecekler için işlenir. Meyvenin yoğun rengi ve lezzeti, olgun meyvelerde bulunan antosiyaninler, şekerler, asitler ve VOC’lerin bir kombinasyonunun sonucudur16,17,18. Frenk üzümü uçucularının analizi 1960’lı yıllara kadar uzanıyor19,20,21. Daha yakın zamanlarda, çeşitli çalışmalar siyah frenk üzümü VOC’lerine odaklanmış, meyve aroması algısı için önemli bileşikleri tanımlamış ve genotip, çevre veya depolama ve işleme koşullarının VOC içeriği üzerindeki etkisini değerlendirmektedir5,17,18,22,23.
Çok sayıda avantajı nedeniyle, yüksek verimli geçici profil oluşturma için tercih tekniği HS-SPME/GC-MS24,25’tir. Polimerik faz ile kaplanmış bir silika elyaf, bir şırıngam cihazına monte edilir ve bir denge aşamasına ulaşılana kadar lifdeki uçucuların adsorpsiyonunun sağlanmasını sağlar. Headspace ekstraksiyonu, elyafı matriste bulunan kalıcı bileşiklerden korur24. SPME, yüksek değişken konsantrasyonlarda (milyarda bir parça ile milyonda bir parça) bulunan yüksek sayıda VOC’yi başarıyla izole edebilir 25. Ek olarak, sınırlı numune işleme gerektiren solvent içermeyen bir tekniktir. HS-SPME’nin diğer avantajları otomasyon kolaylığı ve nispeten düşük maliyetidir.
Bununla birlikte, VOC’lerin kimyasal doğasına, ekstraksiyon protokolüne (zaman, sıcaklık ve tuz konsantrasyonu dahil), numune stabilitesine ve yeterli meyve dokusunun mevcudiyetine bağlı olarak başarısı sınırlanabilir26,27. Bu makale, HS-SPME tarafından izole edilen ve bir iyon kapan kütle spektrometresi ile birleştirilmiş gaz kromatografisi ile analiz edilen siyah frenk üzümü VOC’leri için bir protokol sunun. Bazıları bu çalışmada sunulan yüksek sayıda frenk üzümü örneğini işleyebilmek için bitki materyali miktarı, numune stabilitesi ve ekstraksiyon süresi ile kromatografi arasında bir denge sağlanmıştır. Özellikle, beş kültivarın (‘Andega’, ‘Ben Tron’, ‘Ben Gairn’, ‘Ben Tirran’ ve ‘Tihope’) VOC profilleri ve/veya kromatogramları örnek veri olarak sunulacak ve tartışılacaktır. Ayrıca, çilek (Fragaria x ananassa), ahududu (Rubusidaeus) ve yaban mersini (Vaccinium spp.) gibi diğer meyveli meyve türlerinde VOC ölçümü için aynı protokol başarıyla uygulamaya konmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Meyve aroması için üreme, uçucu bileşiklerin sentezinin altında kalan karmaşık genetik ve biyokimya ve uygun fenotipleme için teknolojilerin eksikliği nedeniyle uzun zamandır engellenmiştir. Bununla birlikte, metabolomik platformlardaki son gelişmeler, genomik araçlarla birlikte, nihayet tüketici tercihlerinden sorumlu metabolitlerin tanımlanmasına ve gelişmiş lezzete sahip mahsullerin yetiştirilmesine izin vermektedir3. Model meyve, domates9,10’da en fa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, HS-SPME/GC-MS ölçümleri için Malaga Üniversitesi’nden Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación’a teşekkür ediyor. Sara Fernández-Palacios Campos’un uçucu nicelikteki yardımını kabul ediyoruz. GoodBerry’nin konsorsiyum üyelerine de meyve malzemesini sağladıkları için teşekkür ediyoruz.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ‘ omics’ approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., Antonio, C., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A., Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1284, 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
