En headspace solid-fase mikroextraction-gas-kromatografi platform er beskrevet her for hurtig, pålidelig og semi-automatiseret flygtig identifikation og kvantificering i modne solbær frugter. Denne teknik kan bruges til at øge viden om frugt aroma og til at vælge sorter med forbedret smag med henblik på avl.
Der er en stigende interesse for at måle flygtige organiske forbindelser (VOC), der udledes af modne frugter med henblik på avl af sorter eller sorter med forbedrede organoleptiske egenskaber og dermed for at øge forbrugernes accept. Metabolomiske platforme med høj gennemløb er for nylig blevet udviklet til at kvantificere en bred vifte af metabolitter i forskellige plantevæv, herunder nøgleforbindelser, der er ansvarlige for frugtsmag og aromakvalitet (volatilomics). En metode ved hjælp af headspace solid-fase mikroextraction (HS-SPME) kombineret med gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) er beskrevet her til identifikation og kvantificering af VOC’er, der udsendes af modne solbærfrugter, et bær, der er meget værdsat for dets smags- og sundhedsmæssige fordele.
Modne frugter af solbærplanter (Ribes nigrum) blev høstet og direkte frosset i flydende nitrogen. Efter vævs homogenisering for at producere et fint pulver blev prøverne optøet og straks blandet med natriumchloridopløsning. Efter centrifugering blev supernatanten overført til et headspace glasglasglasglas, der indeholdt natriumchlorid. VOC’er blev derefter udvundet ved hjælp af en solid-fase mikroextraction (SPME) fiber og en gaskromatograf koblet til en ion fælde massespektrometer. Flygtig kvantificering blev udført på de resulterende ionkromatogrammer ved at integrere spidsbelastningsområde ved hjælp af en bestemt m/z ion for hver VOC. Korrekt VOC-anmærkning blev bekræftet ved at sammenligne retentionstider og massespektre af rene kommercielle standarder, der kører under de samme betingelser som prøverne. Mere end 60 VOC’er blev identificeret i modne solbærfrugter dyrket i kontrasterende europæiske steder. Blandt de identificerede VOC’er kan vigtige aromaforbindelser, såsom terpenoider og C6-flygtige stoffer, bruges som biomarkører for solbærfrugtkvalitet. Derudover diskuteres fordele og ulemper ved metoden, herunder potentielle forbedringer. Desuden er brugen af kontroller til batchkorrektion og minimering af afdriftsintensitet blevet fremhævet.
Smag er et væsentligt kvalitetstræk for enhver frugt, der påvirker forbrugernes accept og dermed væsentligt påvirker omsætteligheden. Smagsopfattelse indebærer en kombination af smags- og olfaktoriske systemer og afhænger kemisk af tilstedeværelsen og koncentrationen af en bred vifte af forbindelser, der akkumuleres i spiselige plantedele, eller i tilfælde af VOC’er, der udsendes af den modne frugt1,2. Mens traditionel avl har fokuseret på agronomiske træk såsom udbytte og skadedyrsresistens, frugt kvalitet træk forbedring, herunder smag, har længe været forsømt på grund af den genetiske kompleksitet og vanskeligheden ved korrekt fænotype disse egenskaber, hvilket fører til forbrugernes utilfredshed3,4. Nylige fremskridt inden for metabolomiske platforme har haft succes med at identificere og kvantificere nøgleforbindelser, der er ansvarlige for frugtsmag og aroma5,6,7,8. Desuden giver kombinationen af metabolitprofilering med genomiske eller transskriptomiske værktøjer mulighed for at belyse den genetik, der ligger til grund for frugtsmagen, hvilket igen vil hjælpe avlsprogrammer med at udvikle nye sorter med forbedrede organoleptiske egenskaber2,4,9,10,11,12,13,14.
Solbær (Ribes nigrum) bær er meget værdsat for deres smag og ernæringsmæssige egenskaber, der dyrkes bredt på tværs af de tempererede zoner i Europa, Asien og New Zealand15. Det meste af produktionen forarbejdes til fødevarer og drikkevarer, som er meget populære i De Nordiske Lande, primært på grund af bærenes organoleptiske egenskaber. Den intense farve og smag af frugten er resultatet af en kombination af anthocyaniner, sukkerarter, syrer og VOC’er til stede i de modne frugter16,17,18. Analysen af solbær flygtige går tilbage til 1960’erne19,20,21. For nylig har flere undersøgelser fokuseret på solbær VOC’er, identificere vigtige forbindelser til frugtaromaopfattelse og vurdering af virkningen af genotype, miljø eller opbevarings- og forarbejdningsforhold på VOC-indhold5,17,18,22,23.
På grund af dens mange fordele er den foretrukne teknik til højgennemsigtigt flygtig profilering HS-SPME/GC-MS24,25. En silica fiber, belagt med en polymer fase, er monteret på en sprøjte enhed, så adsorption af flygtige stoffer i fiberen, indtil en ligevægt fase er nået. Headspace ekstraktion beskytter fiberen mod nonvolatile forbindelser til stede i matrix24. SPME kan med succes isolere et stort antal VOC’er, der er til stede ved meget variable koncentrationer (dele pr. milliard til dele pr. million)25. Derudover er det en opløsningsmiddelfri teknik, der kræver begrænset prøvebehandling. Andre fordele ved HS-SPME er den lette automatisering og dens relativt lave omkostninger.
Dens succes kan dog begrænses, afhængigt af VOC’ernes kemiske karakter, ekstraktionsprotokollen (herunder tid, temperatur og saltkoncentration), prøvestabilitet og tilgængeligheden af tilstrækkeligt frugtvæv26,27. Dette papir præsenterer en protokol for solbær VOC’er isoleret af HS-SPME og analyseret af gaskromatografi kombineret med en ion fælde massespektrometer. Der blev opnået en balance mellem mængden af plantemateriale, prøvestabilitet og varigheden af ekstraktion og kromatografi for at kunne behandle et stort antal solbærprøver, hvoraf nogle blev præsenteret i denne undersøgelse. Navnlig vil VOC-profiler og/eller kromatrammer af fem sorter (»Andega«, »Ben Tron«, »Ben Gairn«, »Ben Tirran« og »Tihope« blive præsenteret og diskuteret som eksempeldata. Desuden er den samme protokol med succes blevet gennemført til VOC-måling hos andre frugtbærarter som jordbær (Fragaria x ananassa), hindbær (Rubusidaeus) og blåbær (Vaccinium spp.).
Avl for frugt aroma har længe været hæmmet af den komplekse genetik og biokemi, der ligger til grund for syntesen af flygtige forbindelser og manglen på teknologier til korrekt phenotyping. Men de seneste fremskridt inden for metabolomiske platforme kombineret med genomiske værktøjer tillader endelig identifikation af de metabolitter, der er ansvarlige for forbrugernes præferencer og for at opdrætte afgrøder med forbedret smag3. Mens de fleste fremskridt er opnået i modellen frugt, <sup …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación fra University of Malaga for HS-SPME/GC-MS målinger. Vi anerkender Sara Fernández-Palacios Campos’ bistand i forbindelse med flygtig kvantificering. Vi takker også GoodBerry’s konsortium medlemmer for at levere frugt materiale.
10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
Sodium chloride | Merck | S9888 | |
SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |