마그나포테 오리자에서 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 방법을 이용한 히스톤 수정 분포의 게놈 전체 분석

Summary

여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

크로마틴 면역 침전 시퀀싱(ChIP-seq)은 전사 인자(TF), 크로마티안 레귤레이터 및 히스톤 수정의 전체 게놈 위치를 매핑하고 TF 결합 패턴 및 그의 톤 후번역 변형을 밝히기 위한 전체 게놈을 검출하기 위한 강력하고 널리 사용되는 분자 기술입니다. 히스톤 메틸화와 같은 크로마틴 수정 활동은 종종 특정 유전자 조절 서열에 채용되어 크로마틴 구조의 국소적 변화를 일으키고 특정 전사 효과를 초래합니다. 쌀 폭발은 전 세계적으로 쌀에 치명적인 곰팡이 질병이며 곰팡이 식물 상호 작용을 연구하기위한 모델 시스템입니다. 그러나, 히스톤 수정이 Magnaporthe oryzae에 있는 그들의 독성 유전자를 통제하는 방법에 있는 분자 기계장치는 애매하게 남아 있습니다. 더 많은 연구원은 그의 음색 후생유전학 수정이 그들의 표적 유전자를 통제하는 방법을 연구하기 위하여 ChIP-seq를 이용할 필요가 있습니다. ChIP-seq는 또한 동물과 식물에 있는 단백질과 DNA 사이 상호 작용을 연구하기 위하여 널리 이용됩니다, 그러나 식물 병리학의 분야에서 적게 이용되고 잘 개발되지 않았습니다. 본 논문에서는, M. oryzae에서 기능적 표적 유전자에 결합하는 히스톤 메틸화(예: H3K4me3)의 게놈 전체 분포를 확인하기 위해 ChIP-seq의 실험 과정 및 작동 방법을 설명한다. 여기서, 우리는 M. oryzae 및 그밖 필라멘트 균류의 병기에서 새로운 표적 유전자를 확인할 수 있는 히스톤 수정의 게놈 전체 분포를 분석하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

Introduction

후성 유전학은 유전자의 뉴클레오티드 서열을 변경하지 않고 유전자 발현의 유전적 변화를 지칭하는 유전 연구의 한 가지이다. 후생유전학적 조절이 고차^구조로접기 및 조립의 동적 과정을 통해 유전자 발현을 조절하고 영향을 미치는 크로마티닌을 포함한 진핵세포의 성장과 발달에 중요한 역할을 한다는 것을^{보여주었다.} 크로마틴 리모델링 및 공유 히스톤 수정은 크로마틴 폴리머의 변이를 통해 크로마틴의 기능 및 구조를 조절하여 유전자 발현^3,4,5,6을조절하는 기능을 달성한다. 히스톤의 번역 후 변형은 아세틸화, 인산화, 메틸화, 일축비퀴티니션, 스모틸화 및 ADP 리보실레이션^7,8,9를포함한다. 히스톤 H3K4 메틸화, 특히 트리메틸화는, 진핵생물^10,11에서전사 복제, 재조합, 수리 및 RNA 처리와 관련된 전사 시작 부위에 매핑되었다.

ChIP-seq 기술은 2007년에 도입되었으며, 전사 조절 및 후성유전학^{기전(12,13)의}게놈 전체 분석을 위한 실험 표준이 되었다. 이 방법은 게놈 전체 규모와 DNA 결합 단백질의 DNA 세그먼트를 포함하는 히스톤 또는 전사 인자 상호 작용 정보를 얻기에 적합합니다. 관심 있는 단백질에 교차된 모든 DNA 순서는 크로마틴 복합체의 일부로 coprecipitate 것입니다. 차세대 염기서열 분석 기술은 또한 36-100 bp의 DNA를 서열화하는 데 사용되며, 이는 해당 표적 게놈과 일치한다.

식물성 균류에서, 연구는 최근에 히스톤 메틸화 수정이 병원성 과정에서 그들의 표적 유전자를 통제하는 방법을 연구하기 시작했습니다. 몇몇 이전 연구 결과는 히스톤 메틸라제 관련 유전자의 규정이 주로 유전자 침묵과 이차 대사 산물 (SM)의 생산을 촉매에 반영한다는 것을 증명했습니다. MoSet1은 M. 오리자에 있는 H3K4 메틸라제입니다. 이 유전자의 녹아웃은 H3K4me3 수정^14의완전한 삭제를 초래한다. 야생형 균주와 비교하여, 돌연변이체내의 MoCEL7C 유전자의 발현은 CMC 유도 상태 및 비유도 상태(포도당 또는 셀로바이오세)에서 억제되며, MoCEL7C의 발현은^{15증가하였다.} 후사리움 에서,KMT6는 H3K27me3의 메틸화 변형을 촉매하고, 곰팡이의 정상적인 발달을 조절하고, SM 유전자^{클러스터(16, 17,18,19)를}포함하는 “비밀게놈”을 조절하는 데 도움을 줄 수 있다. 2013년, 코놀리는 H3K9와 H3K27 메틸화가 표적^{유전자(20)의}억제를 조절하는 이차 대사산물 및 이펙터 인자를 통해 곰팡이의 병원성 과정을 조절한다고 보고했다. 아스퍼길러스에서는,히스톤 H3K4me2 및 H3K4me3의 변형은 유전자 활성화와 관련이 있으며 SM 유전자^{클러스터(21)의}크로마틴 수준 조절을 제어하는 데 중요한 역할을 한다. M. oryzae에서,Tig1 (효모및 포유동물의 티그1에 동종)은 HADC (히스톤 디스티틸라제)^22이다. Tig1 유전자의 녹아웃은 null 돌연변이체에서 병원성과 포자 생산 능력의 완전한 손실로 이어집니다. 감염성^{최해(22)를}생성할 수 없는 peroxygen 환경에 더 민감하다.

M. oryzae.에 의한 쌀 폭발은 세계에서 가장 큰 쌀 재배 지역에서 가장 심각한 쌀 질환 중 하나입니다^19. 그것의 대표적인 감염 과정 때문에, M. oryzae는 많은 중요한 병원성 균류의 감염 과정과 유사합니다. 분자 유전 적 작업을 쉽게 수행 할 수 있기 때문에 곰팡이식물 상호 작용^(23)을연구하기위한 모델 유기체가되었습니다. M. oryzae의 감염 과정의 모든 단계를 차단하면 감염이 실패 할 수 있습니다. 감염 과정 동안 형태학적 변화는 전체 게놈 기능 및 유전자 전사에 의해 엄격하게 조절된다. 그 중에서도 히스톤 메틸화와 같은 후성유전학적 변형은 기능성^{유전자(24,25)의}전사 조절에 필수적인 역할을 한다. 그러나, 지금까지, M. oryzae에 있는 병인 유전자의 전사에 있는 히스톤 메틸화 및 히스톤 아세틸화와 같은 후성 유전학 적 변형의 분자 기계장치에 몇몇 연구 결과가 행해졌습니다. 따라서, 이러한 병원성 관련 유전자의 상류 및 하류 규제 네트워크를 연구하면서 쌀 폭발 곰팡이의 후성유전학 적 조절 메커니즘을 더욱 개발하는 것은 쌀 폭발 예방 및 제어 전략을 개발하는 데 도움이 될 것이다.

ChIP-seq와 같은 기능성 유전체학의 발달, 특히 후성 유전학에서, 이 높은 처리량 데이터 수집 방법은 염색체에 대한 연구를 가속화했습니다. ChIP-seq 실험 기술을 사용하여, M. oryzae 및 기타 필라멘트 균류에서 히스톤 메틸레이션(예: H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3)의 게놈 전체 분포를 식별할 수 있다. 따라서,이 방법은 후성 유전학 수정이 식물 병리학에서 곰팡이 병인 동안 후보 대상 유전자를 조절하는 방법 의 밑에 분자 메커니즘을 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Protocol

1. M. 오리자에서 프토플라스트 준비 오트밀 토마토 한천(OTA)을 준비합니다. 오트밀 30-50g의 무게와 20 분 동안 물 (ddH2O)의 800 mL로 끓입니다. 거즈의 두 층을 통해 필터링하고 여과를 가져 가라. 잘 익은 토마토를 고르고 껍질을 벗깁니다. 주스를 짜내고, 거즈 2층을 걸이면 여과주스 150mL를 수집합니다. 모든 토마토 주스와 준비된 귀리 여과를 완전히 섞고 …

Representative Results

ChIP-seq 메서드의 전체 흐름 차트는 도 1에표시됩니다. ChIP-seq 실험은 야생형 균주 P131 및 모폭2, 모스프1및 moswd2 유전자가 없는 3개의 null 돌연변이 균주에서 H3K4me3에 대한 항체를 사용하여 M. oryzae에서히스톤 H3K4me3 분포의 전체 게놈 전체 프로파일을 검증하였다. 야생형 스트레인, Δmobre2,Δmospp1및 Δmoswd2의 프톱서스트는 25% W, 출력 …

Discussion

최근에는 ChIP-seq가 특정 히스톤에 의해 변형된 TF 또는 농축 부위의 결합 부위를 결정하는 데 널리 사용되는 게놈 분석 방법이 되고 있다. 이전 ChIP-seq 기술과 비교하여 새로운 ChIP-seq 기술은 매우 민감하고 유연합니다. 결과는 핵산의 비특이적 혼성화에 의한 잡음 신호와 같은 부정적인 영향 없이 고해상도로 제공된다. 이것은 일반적인 유전자 발현 분석이지만, 많은 계산 방법이 검증되었으며, 소?…

Materials

acidic casein hydrolysate	WAKO	65072-00-6	Medium configuration
agar powder	scientan	9002-18-0	Medium configuration
deoxycholic acid	MedChemExpress	83-44-3	protein and dissolution
DNA End-Repair kit	NovoBiotec	ER81050	Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing
Dynabeads	Invitrogen	no.100.02D	Binding target
EB buffer	JIMEI	JC2174	Membrane and liquid
EDTA	ThermoFisher	AM9912	protease inhibitor
enzymatic casein hydrolysate	Sigma	91079-40-2	Medium configuration
glucose	Sigma	50-99-7	Medium configuration
glycogen	ThermoFisher	AM9510	Precipitant action
H3K4me3 antibodies	Abcam	ab8580	Immune response to H3K4me3 protein
illumina Genome Analyzer	illumina	illumina Hiseq 2000	Large configuration
Illumina PCR primers	illumina	CleanPlex	Random universal primer
isoamyl alcohol	chemical book	30899-19-5	Purified DNA
LiCl	ThermoFisher	AM9480	specific removal RNA
lysing enzymes	Sigma	L1412-10G	cell lysis buffer
Mouse IgG	Yeasen	36111ES10	Animal normal immunoglobulin
NaCl solution	ThermoFisher	7647-14-5	Medium configuration
NaHCO3	Seebio	SH30173.08*	preparation of protein complex eluent
NP-40	ThermoFisher	85124	cell lysate to promote cell lysis
PCR Purification kit	Qiagen	28004	The purification procedure removes primers from DNA samples
protease inhibitors	ThermoFisher	A32965	A protein inhibitor that decreases protein activity
Proteinase K	ThermoFisher	AM2546	DNA Extraction Reagent
Qubit 4.0	ThermoFisher	Q33226	Medium configuration
RIPA buffer	ThermoFisher	9806S	cell lysis buffer
RNase A	ThermoFisher	AM2271	Purified DNA
SDS	ThermoFisher	AM9820	cover up the charge differences
sodium acetate solution	ThermoFisher	R1181	Acetic acid buffer
sodium deoxycholate	ThermoFisher	89904	inhibition of protease degradation
T4 DNA ligase	ThermoFisher	EL0011	Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase
T4 DNA ligase buffer	ThermoFisher	B69	DNA ligase buffer
Tris-HCl	ThermoFisher	1185-53-1	buffer action
Triton X-100	ThermoFisher	HFH10	keep the membrane protein stable
yeast extract	OXOID	LP0021	Medium configuration