Genom-dækkende Analyse af Histone Modifications Distribution ved hjælp af Chromatin Immunprecipitation Sekventering Metode i Magnaporthe oryzae

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at analysere genomomomfordelingen af histonemodifikationer, som kan identificere nye målgener i patogenesen af M. oryzae og andre filamentøse svampe.

Abstract

Chromatin immunprecipitation sekventering (ChIP-seq) er en kraftfuld og udbredt molekylær teknik til kortlægning af hele genom steder transskription faktorer (TFs), kromatin regulatorer, og histone modifikationer, samt detektering hele genomer til at afdække TF bindende mønstre og histone posttranslationelle ændringer. Kromatin-modificerende aktiviteter, såsom histone methylering, rekrutteres ofte til specifikke genregulerende sekvenser, hvilket forårsager lokaliserede ændringer i kromatinstrukturer og resulterer i specifikke transskriptionelle virkninger. Ris blast er en ødelæggende svampesygdom på ris i hele verden og er et modelsystem til at studere svamp-plante interaktion. Men de molekylære mekanismer i, hvordan histone modifikationer regulerer deres virulens gener i Magnaporthe oryzae forbliver undvigende. Flere forskere er nødt til at bruge ChIP-seq til at studere, hvordan histone epigenetiske modifikation regulerer deres mål gener. ChIP-seq er også meget udbredt til at studere samspillet mellem protein og DNA hos dyr og planter, men det er mindre anvendt inden for plantepatologi og er ikke blevet veludviklet. I dette papir beskriver vi den eksperimentelle proces og driftsmetode af ChIP-seq for at identificere genomomomfordelingen af histone methylering (såsom H3K4me3), der binder sig til de funktionelle målgener i M. oryzae. Her præsenterer vi en protokol til at analysere genomomomfordelingen af histonemodifikationer, som kan identificere nye målgener i patogenesen af M. oryzae og andre filamentøse svampe.

Introduction

Epigenetik er en gren af genetisk forskning, der refererer til den arvelige ændring af genekspression uden at ændre nukleotidsekvensen af gener. Et stigende antal undersøgelser har vist, at epigenetisk regulering spiller en vigtig rolle i væksten og udviklingen af eukaryote celler, herunder kromatin, der regulerer og påvirker genekspression gennem den dynamiske proces med at folde og samle sig i strukturer af højere orden^1,2. Chromatin remodeling og kovalent histone modifikation påvirker og regulerer kromatins funktion og struktur gennem variationen af kromatin polymerer, og derved opnå funktionen af regulering af genekspression^3,4,5,6. Posttranslationelle modifikationer af histone omfatter acetylation, fosforylering, methylering, monoubiquitination, sumoylation og ADP ribosylation^7,8,9. Histone H3K4 methylering, især trimethylation, er blevet kortlagt til transskription start steder, hvor det er forbundet med transskription replikation, rekombination, reparation, og RNA behandling i eukaryoter^10,11.

ChIP-seq-teknologi blev introduceret i 2007 og er blevet den eksperimentelle standard for genomom-dækkende analyse af transskriptionel regulering og epigenetiske mekanismer^12,13. Denne metode er velegnet i genom-skala og til at opnå histone eller transskription faktor interaktion oplysninger, herunder DNA segmenter af DNA-bindende proteiner. Enhver DNA-sekvenser krydslinket til proteiner af interesse vil coprecipitate som en del af kromatin kompleks. Ny generation sekventering teknikker bruges også til sekvens 36-100 bp af DNA, som derefter matches til det tilsvarende mål genom.

I phytopathogene svampe er forskning for nylig begyndt at studere, hvordan histone methyleringsændringer regulerer deres målgener i processen med patogenitet. Nogle tidligere undersøgelser viste, at reguleringen af histone methylase-relaterede gener hovedsageligt afspejles i genhæmning og katalysering af produktionen af sekundære metabolitter (SM). MoSet1 er H3K4 methylase i M. oryzae. Knockout af dette gen resulterer i fuldstændig sletning af H3K4me3 modifikation¹⁴. Sammenlignet med den vilde stamme hæmmes udtrykket af genet MoCEL7C i mutanten i CMC-induceret tilstand og i ikke-induceret tilstand (glukose eller cellobiose),¹⁵udtrykket af MoCEL7C . I Fusarium graminearumkan KMT6 katalysere methyleringsmodifikationen af H3K27me3, regulere den normale udvikling af svampe og hjælpe med at regulere det “kryptiske genom”, der indeholder SM-genklyngen^16,17,18,19. I 2013 rapporterede Connolly, at H3K9 og H3K27 methylering regulerer den patogene proces af svampe gennem sekundære metabolitter og effektorfaktorer, der regulerer hæmningen af målgener²⁰. I Aspergilluser modifikationen af histonerne H3K4me2 og H3K4me3 relateret til genaktivering og spiller en vigtig rolle i kontrollen af kromatinniveaureguleringen af SM-genklynger²¹. I M. oryzaeer Tig1 (homolog til Tig1 i gær og pattedyr) en HADC (histone deacetylase)²². Knockout af Tig1-genet fører til fuldstændig tab af patogenitet og sporeproduktionsevne i null mutant. Det er mere følsomt over for et peroxygenmiljø, som ikke kan producere infektiøs hyphae²².

Ris blast forårsaget af M. oryzae. er en af de mest alvorlige ris sygdomme i de fleste ris-voksende områder i verden¹⁹. På grund af sin repræsentative infektionsproces ligner M. oryzae infektionsprocessen for mange vigtige patogene svampe. Da det nemt kan udføre molekylære genetiske operationer, er svampen blevet en modelorganisme til undersøgelse af svampe-planteinteraktioner²³. Blokering hvert trin i infektionsprocessen af M. oryzae kan resultere i mislykket infektion. De morfologiske ændringer under infektionsprocessen er strengt reguleret af hele genomfunktionen og gentransskriptionen. Blandt dem spiller epigenetiske modifikationer som histone methylering en væsentlig rolle i transskriptionionen af funktionelle gener^24,25. Men indtil videre er der kun gjort få undersøgelser af den molekylære mekanisme af epigenetiske modifikationer som histone methylering og histoneactylation i transskriptionen af patogenesegener i M. oryzae. Derfor vil yderligere udvikling af den epigenetiske reguleringsmekanisme for ris blast svamp, mens researchinh opstrøms og downstream regulatoriske netværk af disse patogene relaterede gener bidrage til at udvikle ris blast forebyggelse og kontrol strategier.

Med udviklingen af funktionelle genomforskninger som ChIP-seq, især i epigenetik, har denne high-throughput dataindsamlingsmetode fremskyndet forskning i kromosomer. Ved hjælp af ChIP-seq eksperimentel teknologi kan genomomfordelingen af histone methylering (såsom H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) i M. oryzae og andre filamentøse svampe identificeres. Derfor kan denne metode hjælpe med at belyse de molekylære mekanismer, der ligger til grund for, hvordan epigenetiske modifikationer regulerer deres kandidatmålgener under svampepatogenese i plantepatologi.

Protocol

1. Fremstilling af protoplaster fra M. oryzae Forbered havregryn-tomat agar (OTA). Afvej 30-50 g havregryn og kog den i 800 mL vand (ddH2O) i 20 min. Filtrer gennem to lag gaze og tag filtratet. Vælg modne tomater og skræl dem. Klem saften, og filtrer gennem to lag gaze for at opsamle 150 mL af den filtrerede saft. Bland al tomatsaft og den forberedte havrefiltrat grundigt og tilsæt ddH2O op til 1000 mL. Tilsæt 250 mL af OTA og 2,5 g ag…

Representative Results

Hele rutediagrammet for ChIP-seq-metoden vises i figur 1. ChIP-seq-eksperimenter blev udført ved hjælp af antistoffer mod H3K4me3 i den vilde stamme P131 og tre null mutant stammer, der var blottet for mobre2, mospp1og moswd2 gen for at kontrollere hele genomet-dækkende profil af histone H3K4me3 fordeling i M. oryzae. Protoplasterne af den vilde stamme, Δmobre2,Δmospp1og Δmoswd2, blev forberedt og sonikeret ved 25% W, outpu…

Discussion

For nylig er ChIP-seq blevet en meget anvendt genomisk analysemetode til bestemmelse af de bindende websteder for TF’er eller berigelsessteder, der er ændret af specifikke histoner. Sammenlignet med tidligere ChIP-seq-teknologi er den nye ChIP-seq-teknologi meget følsom og fleksibel. Resultaterne leveres i høj opløsning uden negative virkninger, såsom støjsignalet forårsaget af den ikke-specifikke hybridisering af nukleinsyrer. Selv om dette er en fælles genekspression analyse, mange beregningsmæssige metoder er…

Materials

acidic casein hydrolysate	WAKO	65072-00-6	Medium configuration
agar powder	scientan	9002-18-0	Medium configuration
deoxycholic acid	MedChemExpress	83-44-3	protein and dissolution
DNA End-Repair kit	NovoBiotec	ER81050	Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing
Dynabeads	Invitrogen	no.100.02D	Binding target
EB buffer	JIMEI	JC2174	Membrane and liquid
EDTA	ThermoFisher	AM9912	protease inhibitor
enzymatic casein hydrolysate	Sigma	91079-40-2	Medium configuration
glucose	Sigma	50-99-7	Medium configuration
glycogen	ThermoFisher	AM9510	Precipitant action
H3K4me3 antibodies	Abcam	ab8580	Immune response to H3K4me3 protein
illumina Genome Analyzer	illumina	illumina Hiseq 2000	Large configuration
Illumina PCR primers	illumina	CleanPlex	Random universal primer
isoamyl alcohol	chemical book	30899-19-5	Purified DNA
LiCl	ThermoFisher	AM9480	specific removal RNA
lysing enzymes	Sigma	L1412-10G	cell lysis buffer
Mouse IgG	Yeasen	36111ES10	Animal normal immunoglobulin
NaCl solution	ThermoFisher	7647-14-5	Medium configuration
NaHCO3	Seebio	SH30173.08*	preparation of protein complex eluent
NP-40	ThermoFisher	85124	cell lysate to promote cell lysis
PCR Purification kit	Qiagen	28004	The purification procedure removes primers from DNA samples
protease inhibitors	ThermoFisher	A32965	A protein inhibitor that decreases protein activity
Proteinase K	ThermoFisher	AM2546	DNA Extraction Reagent
Qubit 4.0	ThermoFisher	Q33226	Medium configuration
RIPA buffer	ThermoFisher	9806S	cell lysis buffer
RNase A	ThermoFisher	AM2271	Purified DNA
SDS	ThermoFisher	AM9820	cover up the charge differences
sodium acetate solution	ThermoFisher	R1181	Acetic acid buffer
sodium deoxycholate	ThermoFisher	89904	inhibition of protease degradation
T4 DNA ligase	ThermoFisher	EL0011	Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase
T4 DNA ligase buffer	ThermoFisher	B69	DNA ligase buffer
Tris-HCl	ThermoFisher	1185-53-1	buffer action
Triton X-100	ThermoFisher	HFH10	keep the membrane protein stable
yeast extract	OXOID	LP0021	Medium configuration