Análisis cuantitativo basado en microscopía de escaneo láser confocal de la distribución de conidios de Aspergillus fumigatus en pulmón de ratón ópticamente despejado de montaje entero
Summary
Describimos el método para el análisis cuantitativo de la distribución de Aspergillus fumigatus conidia (3 μm de tamaño) en las vías respiratorias de ratones. El método también se puede utilizar para el análisis de micropartículas y la distribución de aglomerado de nanopartículas en las vías respiratorias en varios modelos de condiciones patológicas.
Abstract
Aspergillus fumigatus conidia son patógenos en el aire que pueden penetrar en las vías respiratorias humanas. Las personas inmunocompetentes sin alergias exhiben resistencia y tolerancia inmunológica, mientras que en pacientes inmunocomprometidos, los conidios pueden colonizar las vías respiratorias y causar trastornos respiratorios invasivos graves. Varias células en diferentes compartimentos de las vías respiratorias están involucradas en la respuesta inmune que previene la invasión de hongos; sin embargo, los aspectos espacio-temporales de la eliminación de patógenos aún no se comprenden completamente. Las imágenes tridimensionales (3D) de órganos de montaje entero limpiados ópticamente, particularmente los pulmones de ratones experimentales, permiten la detección de patógenos etiquetados fluorescentemente en las vías respiratorias en diferentes puntos de tiempo después de la infección. En el presente estudio, describimos una configuración experimental para realizar un análisis cuantitativo de la distribución de A. fumigatus conidia en las vías respiratorias. Utilizando microscopía fluorescente de barrido láser confocal (CLSM), rastreamos la ubicación de los conidios marcados fluorescentemente en las ramas bronquiales y el compartimiento alveolar 6 horas después de la aplicación orofaríngea a ratones. El enfoque descrito aquí se utilizó previamente para la detección de la ubicación precisa del patógeno y la identificación de las células que interactúan con el patógeno en diferentes fases de la respuesta inmune. La configuración experimental se puede utilizar para estimar la cinética de la eliminación del patógeno en diferentes condiciones patológicas.
Introduction
Diariamente, las personas inhalan patógenos en el aire, incluidas las esporas de hongos oportunistas Aspergillus fumigatus (A. fumigatus conidia) que pueden penetrar en el tracto respiratorio1. El tracto respiratorio de los mamíferos es un sistema de vías respiratorias de diferentes generaciones que se caracterizan por las diferentes estructuras de las paredes de las vías respiratorias2,3,4. Las paredes traqueobronquiales consisten en varios tipos de células entre las que se encuentran las células ciliadas que proporcionan el aclaramiento mucociliar5. En los alvéolos, no hay células ciliadas y los patógenos espaciales alveolares penetrantes no pueden ser eliminados por el aclaramiento mucociliar6. Además, cada generación de vías respiratorias es un nicho para múltiples poblaciones de células inmunes y subconjuntos de estas poblaciones son únicos para ciertos compartimentos de las vías respiratorias. Así, los macrófagos alveolares residen en los compartimentos alveolares, mientras que tanto la tráquea como las vías respiratorias conductoras están revestidas con las células dendríticas intraepiteliales7,8.
El tamaño aproximado de A. fumigatus conidia es de 2-3.5 μm9. Dado que el diámetro de las vías respiratorias pequeñas en humanos e incluso en ratones supera los 3,5 μm, se sugirió que los conidios pueden penetrar en el espacio alveolar2,10,11. De hecho, el examen histológico mostró el crecimiento fúngico en los alvéolos de los pacientes que sufrían de aspergilosis12. También se detectaron conidios en los alvéolos de ratones infectados utilizando imágenes vivas de las gruesas rodajas pulmonares13. Simultáneamente, se detectaron conidios en el lado luminal del epitelio bronquial de ratones14.
La obtención de imágenes tridimensionales (3D) de los pulmones de ratón de montaje entero ópticamente despejados permite el análisis morfométrico de las vías respiratorias15. En particular, el análisis cuantitativo de la distribución del nervio pleural visceral se realizó utilizando muestras de pulmón de ratón ópticamente despejadas15. Recientemente, Amich et al.16 investigaron el crecimiento de hongos después de la aplicación intranasal de conidios a los ratones inmunocomprometidos utilizando una microscopía de fluorescencia de lámina de luz de muestras de pulmón de ratón ópticamente despejadas. La ubicación precisa de los conidios en reposo en las vías respiratorias en diferentes puntos de tiempo después de la infección es importante para identificar las poblaciones celulares que pueden proporcionar suficiente defensa antifúngica en ciertas fases de la inflamación. Sin embargo, debido al tamaño relativamente pequeño, los aspectos espacio-temporales de la distribución de los conidios de A. fumigatus en las vías respiratorias están mal caracterizados.
Aquí, presentamos una configuración experimental para el análisis cuantitativo de la distribución de A. fumigatus conidia en las vías respiratorias de ratones infectados. Utilizando microscopía fluorescente de barrido láser confocal (CLSM) de pulmones ópticamente despejados de ratones que recibieron una aplicación orofaríngea de los conidios de A. fumigatus marcados fluorescentemente, obtenemos imágenes 3D y realizamos el procesamiento de imágenes. Utilizando imágenes 3D del lóbulo pulmonar de montaje completo, hemos mostrado previamente la distribución de A. fumigatus conidia en la vía aérea conductora de ratones 72 horas después de la aplicación deconidios 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
La obtención de imágenes 3D de órganos completos permite obtener los datos sin disección del espécimen, lo que es de gran importancia para investigar los aspectos espaciales de la distribución anatómica del patógeno en el organismo. Existen varias técnicas y modificaciones de limpieza óptica de tejidos que ayudan a superar la dispersión de la luz láser y permiten la obtención de imágenes de todo el órgano15,16,18,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al Prof. Sven Krappmann (Hospital Universitario de Erlangen y FUA Erlangen-Nürnberg, Alemania) por proporcionar la cepa AfS150 de Aspergillus fumigatus conidia. Los autores agradecen a la Oficina de Prensa del MIPT. V.B. reconoce al Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia (#075-00337-20-03, proyecto FSMG-2020-0003). El trabajo relativo a la obtención y cuantificación de los conidios de A. fumigatus fue apoyado por RSF No 19-75-00082. El trabajo relacionado con las imágenes de las vías respiratorias fue apoyado por RFBR No 20-04-60311.
Materials
| Alexa Fluor 594 NHS Ester | ThermoFisher | A20004 | |
| Aspergillus fumigatus conidia | ATCC | 46645 | The strain AfS150, a ATCC 46645 derivative |
| Benzyl alcohol | Panreac | 141081.1611 | 98.0-100 % |
| Benzyl benzoate | Acros | AC10586-0010 | 99+% |
| C57Bl/6 mice | Pushchino Animal Breeding Centre (Russia) | Male. 12 – 30 week old. | |
| Catheter | Venisystems | G715-A01 | 18G |
| Cell imaging coverglass-bottom chamber | Eppendorf | 30742028 | 4 or 8 well chamber with coverglass bottom |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | Any centrifuge provided 1000 g can be used |
| Confocal laser scanning microscope | ZEISS | ZEISS LSM780 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | ≥99.9% |
| FIJI image processing package | FIJI | Free software | |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD557R | Toothed |
| Forcep | B. Braun Aesculap | BD321R | Fine-tipped |
| Forcep | Bochem | 1727 | Smooth |
| Glass bottle | DURAN | 242101304 | With groung-in lid |
| Graphic Editor Photoshop | Adobe Inc | Adobe Photoshop CS | |
| GraphPad Software | GraphPad | Prism 8 | |
| Imaris Microscopy Imaging Software | Oxford Instruments | Free trial is avalable https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial | |
| Isoflurane | Karizoo | ||
| NaHCO3 | Panreac | 141638 | |
| Objective | ZEISS | 420640-9800-000 | Plan-Apochromat, 10 × (NA = 0.3) |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS | Paneco | P060Π | |
| Pipette | ProLine | 722020 | 5 to 50 μL |
| Powdered milk | Roth | T145.2 | |
| Sample mixer | Dynal | MXIC1 | |
| Scissors | B. Braun | BC257R | Blunt |
| Shaker | Apexlab | GS-20 | 50-300 rpm |
| Skalpel | Bochem | 12646 | |
| Silk thread | B. Braun | 3 USP | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Test tube | SPL Lifesciences | 50050 | 50 mL |
| Tris (hydroxymethyl aminomethane) | Helicon | H-1702-0.5 | Mr 121.14; CAS Number: 77-86-1 |
| Triton X-100 | Amresco | Am-O694-0.1 | |
| ZEN microscope software | ZEISS | ZEN2012 SP5 | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen.html |
References
- O’Gorman, C. M. Airborne Aspergillus fumigatus conidia: A risk factor for aspergillosis. Fungal Biology Reviews. 25 (3), 151-157 (2011).
- Hyde, D. M., et al. Asthma: A comparison of animal models using stereological methods. European Respiratory Review. 15 (101), 122-135 (2006).
- Alanis, D. M., Chang, D. R., Akiyama, H., Krasnow, M. A., Chen, J. Two nested developmental waves demarcate a compartment boundary in the mouse lung. Nature Communications. 5, (2014).
- Kleinstreuer, C., Zhang, Z., Donohue, J. F. Targeted drug-aerosol delivery in the human respiratory system. Annual Review of Biomedical Engineering. 10, (2008).
- Bustamante-Marin, X. M., Ostrowski, L. E. Cilia and mucociliary clearance. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), (2017).
- Fröhlich, E., Salar-Behzadi, S. Toxicological assessment of inhaled nanoparticles: Role of in vivo, ex vivo, in vitro, and in Silico Studies. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4795-4822 (2014).
- Patel, V. I., Metcalf, J. P. Airway macrophage and dendritic cell subsets in the resting human lung. Critical Reviews in Immunology. 38 (4), 303-331 (2018).
- Bogorodskiy, A. O., et al. Murine intraepithelial dendritic cells interact with phagocytic cells during Aspergillus fumigatus-Induced Inflammation. Frontiers in Immunology. 11, (2020).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous fuman fungal pathogen. PLoS Pathogens. 9 (12), 1-4 (2013).
- Overton, N., Gago, S., Bowyer, P. Immunogenetics of chronic and allergic aspergillosis. Immunogenetics of Fungal Diseases. , 153-171 (2017).
- Thiesse, J., et al. Lung structure phenotype variation in inbred mouse strains revealed through in vivo micro-CT imaging. Journal of Applied Physiology. 109 (6), 1960-1968 (2010).
- Tochigi, N., et al. Histopathological implications of Aspergillus infection in lung. Mediators of Inflammation. 2013, (2013).
- Bruns, S., et al. Production of extracellular traps against aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin rodA. PLoS Pathogens. 6 (4), 1-18 (2010).
- Shevchenko, M. A., et al. Aspergillus fumigatus infection-induced neutrophil recruitment and location in the conducting airway of immunocompetent, neutropenic, and immunosuppressed mice. Journal of Immunology Research. 2018, 5379085 (2018).
- Scott, G. D., Blum, E. D., Fryer, A. D., Jacoby, D. B. Tissue optical clearing, three-dimensional imaging, and computer morphometry in whole mouse lungs and human airways. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 1 (51), 43-55 (2014).
- Amich, J., et al. Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-aspergillus fumigatus interactions. mBio. 11 (1), (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. High-dimensional cell-level analysis of tissues with Ce3D multiplex volume imaging. Nat Protoc. 14 (6), 1708-1733 (2019).
- Ertürk, A., Lafkas, D., Chalouni, C. Imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3DISCO. J Vis Exp. (89), e51382 (2014).
- Kuhn, C. Biotin stores in rodent lungs: Localization to Clara and type II alveolar cells. Experimental Lung Research. 14 (4), 527-536 (1988).
