Produktion af monoklonale antistoffer rettet mod aminopeptidase N i svins tarmslimhindepitel
Summary
Det rekombinante antistofprotein udtrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og monoklonale antistoffer produceret ved hjælp af traditionel hybridomteknologi kan genkende og binde til svineaminopeptidase N (APN) proteinet.
Abstract
Porcinaminopeptidase N (APN), en membranbundet metallopeptidase, der er rigeligt til stede i tyndtarmens slimhinde, kan initiere et slimhindeimmunrespons uden interferens, såsom lavt proteinekspression, enzyminaktivitet eller strukturelle ændringer. Dette gør APN til en attraktiv kandidat i udviklingen af vacciner, der selektivt målretter mod slimhindepitelet. Tidligere undersøgelser har vist, at APN er et receptorprotein for både enterotoksinfremkaldende Escherichia coli (E. coli) F4 og overførbar gastroenteritisvirus. APN viser således løfte i udviklingen af antistof-lægemiddelkonjugater eller nye vacciner baseret på APN-specifikke antistoffer. I denne undersøgelse sammenlignede vi produktionen af APN-specifikke monoklonale antistoffer (mAbs) ved hjælp af traditionel hybridomteknologi og rekombinant antistofekspressionsmetode. Vi etablerede også en stabilt transfekteret kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinje ved hjælp af pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN og en E. coli-ekspression BL21 (DE3) stamme, der huser pET28a (+)-rAbs-APN-vektoren . Resultaterne viser, at antistoffer udtrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og mAbs produceret ved hjælp af hybridomer kunne genkende og binde til APN-proteinet. Dette giver grundlag for yderligere belysning af APN-receptorfunktionen til udvikling af lægemidler rettet mod forskellige APN-specifikke epitoper.
Introduction
Aminopeptidase N (APN), et måneskinsenzym, der tilhører metalloproteinase M1-familien, fungerer som en tumormarkør, receptor og signalmolekyle via enzymafhængige og enzymuafhængige veje 1,2. Ud over at spalte de N-terminale aminosyrerester af forskellige bioaktive peptider til regulering af deres biologiske aktivitet spiller APN en vigtig rolle i patogenesen af forskellige inflammatoriske sygdomme. APN deltager i antigenbehandling og præsentation af trimmede peptider, der binder tæt til større histokompatibilitetskomplekserklasse II-molekyler 2,3. APN udøver også antiinflammatoriske virkninger ved at binde med G-proteinkoblede receptorer, der deltager i multipel signaltransduktion, modulerer cytokinsekretion og bidrager til Fc gammareceptormedieret fagocytose i immunresponset 4,5,6,7.
Som en bredt distribueret membranbundet exopeptidase er APN rigelig i svinetyndtarmens slimhinde og er tæt forbundet med receptormedieret endocytose 1,5,8. APN genkender og binder spikeproteinet i den overførbare gastroenteritisvirus til celleindgang og interagerer direkte med FaeG-underenheden af enterotoksinfremkaldende Escherichia coli F4 fimbriae for at påvirke bakteriel adhærens med værtsceller 9,10,11. APN er således et potentielt terapeutisk mål i behandlingen af virale og bakterielle infektionssygdomme.
Siden udviklingen af hybridomteknologi og andre strategier til produktion af monoklonale antistoffer (mAbs) i 1975 har mAbs været meget udbredt i immunterapi, lægemiddelafgivelse og diagnose12,13,14. I øjeblikket anvendes mAbs med succes til behandling af sygdomme, såsom kræft, inflammatorisk tarmsygdom og multipel sklerose12,15. På grund af deres stærke affinitet og specificitet kan mAbs være ideelle mål i udviklingen af antistof-lægemiddelkonjugater (ADC) eller nye vacciner16,17. APN-proteinet er kritisk for selektivt at levere antigener til specifikke celler og kan fremkalde et specifikt og stærkt slimhindeimmunrespons mod patogener uden interferens, herunder lav proteinekspression, enzyminaktivitet eller strukturelle ændringer 5,8,18. Derfor viser terapeutiske produkter baseret på APN-specifikke mAbs løfte mod bakterielle og virale infektioner. I denne undersøgelse beskriver vi produktionen af APN-specifikke mAbs ved hjælp af hybridomteknologi og ekspression af anti-APN rekombinante antistoffer (rAbs) ved hjælp af prokaryote og eukaryote vektorer. Resultatet indikerer, at APN-proteinet blev genkendt af både rAbs udtrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og hybridomafledte mAbs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Induktion af slimhindeimmunitet er en af de mest effektive tilgange til modvirkning af patogener og forebyggelse og behandling af forskellige sygdomme. APN, et højt udtrykt membranbundet protein i tarmslimhinden, er involveret i induktion af adaptivt immunrespons og i receptormedieret viral og bakteriel endocytose 1,5,8. APN anvendes som antigenpartikler i mange formater af antigenbelastning og vaccinelevering. Den orale admini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af Chinese National Science Foundation Grant (nr. 32072820, 31702242), tilskud fra Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) og High-level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation, et projekt grundlagt af Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient’s need. British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
