ブタ腸粘膜上皮におけるアミノペプチダーゼNを標的とするモノクローナル抗体の作製
Summary
pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞で発現する組換え抗体タンパク質と、従来のハイブリドーマ技術を使用して産生されたモノクローナル抗体は、ブタアミノペプチダーゼN(APN)タンパク質を認識して結合することができます。
Abstract
小腸粘膜に豊富に存在する膜結合メタロペプチダーゼであるブタアミノペプチダーゼN(APN)は、低タンパク質発現、酵素不活性、構造変化などの干渉なしに粘膜免疫応答を開始できます。これにより、APNは粘膜上皮を選択的に標的とするワクチンの開発において魅力的な候補となります。以前の研究では、APNが毒素原性 大腸 菌(大腸菌)F4と伝染性胃腸炎ウイルスの両方の受容体タンパク質であることが示されています。したがって、APNは、抗体薬物複合体またはAPN特異的抗体に基づく新規ワクチンの開発において有望である。本研究では、従来のハイブリドーマ技術と遺伝子組換え抗体発現法を用いたAPN特異的モノクローナル抗体(mAb)の産生を比較した。また、pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APNとpET28a(+)-rAbs-APNベクターを保持する 大腸菌 発現BL21(DE3)株を使用して、安定にトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を樹立しました。結果は、pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞およびハイブリドーマを用いて産生されたmAbsで発現する抗体がAPNタンパク質を認識し、結合できることを示しています。これは、異なるAPN特異的エピトープを標的とする治療薬の開発のためのAPN受容体機能のさらなる解明の基礎を提供します。
Introduction
メタロプロテイナーゼM1ファミリーに属する月光酵素であるアミノペプチダーゼN(APN)は、酵素依存性および酵素非依存性の経路を介して腫瘍マーカー、受容体、およびシグナル伝達分子として機能します1,2。APNは、様々な生理活性ペプチドのN末端アミノ酸残基を切断してそれらの生物学的活性を調節することに加えて、様々な炎症性疾患の病因において重要な役割を果たす。APNは、主要組織適合遺伝子複合体クラスII分子に強固に結合するトリミングペプチドによる抗原プロセシングおよび提示に関与しています2,3。APNはまた、複数のシグナル伝達に関与するGタンパク質共役受容体と結合し、サイトカイン分泌を調節し、免疫応答におけるFcガンマ受容体媒介食作用に寄与することにより、抗炎症効果を発揮します4,5,6,7。
広く分布している膜結合型エキソペプチダーゼとして、APNはブタの小腸粘膜に豊富にあり、受容体媒介性エンドサイトーシスと密接に関連しています1,5,8。APNは、細胞侵入のために伝染性胃腸炎ウイルスのスパイクタンパク質を認識して結合し、毒素原性大腸菌F4線ブリアのFaeGサブユニットと直接相互作用して、宿主細胞との細菌接着に影響を与えます9,10,11。したがって、APNは、ウイルスおよび細菌感染症の治療における潜在的な治療標的である。
1975年にモノクローナル抗体(mAb)産生のためのハイブリドーマ技術およびその他の戦略が開発されて以来、mAbは免疫療法、薬物送達、および診断に広く使用されてきました12,13,14。現在、モノクローナル抗体は、癌、炎症性腸疾患、多発性硬化症などの疾患の治療に成功しています12,15。モノクローナル抗体は、その強力な親和性と特異性により、抗体薬物複合体(ADC)や新規ワクチンの開発において理想的な標的となり得る16,17。APNタンパク質は、抗原を特定の細胞に選択的に送達するために重要であり、低タンパク質発現、酵素不活性、または構造変化を含む干渉なしに、病原体に対する特異的で強力な粘膜免疫応答を誘発することができる5,8,18。したがって、APN特異的モノクローナル抗体に基づく治療用製品は、細菌およびウイルス感染に対して有望です。本研究では、ハイブリドーマ技術を用いたAPN特異的モノクローナル抗体の産生、および原核生物および真核生物ベクターを用いた抗APN組換え抗体(rAbs)の発現について述べる。この結果は、APNタンパク質がpIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO細胞およびハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体の両方で発現したrAbsによって認識されたことを示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
粘膜免疫の誘導は、病原体に対抗し、さまざまな疾患の予防と治療において最も効果的なアプローチの1つです。腸粘膜で高発現する膜結合タンパク質であるAPNは、適応免疫応答の誘導および受容体媒介性のウイルスおよび細菌のエンドサイトーシスに関与しています1,5,8。APNは、抗原負荷およびワクチン送達の多くの形態…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家科学基金会助成金(第32072820号、31702242)、江蘇省政府海外研究奨学金(JS20190246)からの助成金、および江蘇省高等教育機関開発優先学術プログラムによって設立されたプロジェクトである揚州大学科学研究基金会の高レベルの才能によって支援されました。
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
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