Produksjon av monoklonale antistoffer rettet mot aminopeptidase N i tarmslimhinneepitelet hos svin
Summary
Det rekombinante antistoffproteinet uttrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og monoklonale antistoffer produsert ved hjelp av tradisjonell hybridoma-teknologi kan gjenkjenne og binde seg til porcinaminopeptidase N (APN) proteinet.
Abstract
Svineaminopeptidase N (APN), en membranbundet metallopeptidase som er rikelig tilstede i tynntarmslimhinnen, kan initiere en mukosal immunrespons uten forstyrrelser som lavt proteinuttrykk, enzyminaktivitet eller strukturelle endringer. Dette gjør APN til en attraktiv kandidat i utviklingen av vaksiner som selektivt retter seg mot slimhinneepitelet. Tidligere studier har vist at APN er et reseptorprotein for både enterotoksigene Escherichia coli (E. coli) F4 og overførbart gastroenterittvirus. Dermed viser APN løfte om utvikling av antistoff-legemiddelkonjugater eller nye vaksiner basert på APN-spesifikke antistoffer. I denne studien sammenlignet vi produksjon av APN-spesifikke monoklonale antistoffer (mAbs) ved bruk av tradisjonell hybridoma-teknologi og rekombinant antistoffekspresjonsmetode. Vi etablerte også en stabilt transfektert kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinje ved bruk av pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN og en E. coli-uttrykk BL21 (DE3) stamme som inneholder pET28a (+) -rAbs-APN-vektoren. Resultatene viser at antistoffer uttrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og mAbs produsert ved hjelp av hybridomer kunne gjenkjenne og binde seg til APN-proteinet. Dette gir grunnlag for videre belysing av APN-reseptorfunksjonen for utvikling av terapeutika rettet mot ulike APN-spesifikke epitoper.
Introduction
Aminopeptidase N (APN), et måneskinnsenzym som tilhører metalloproteinase M1-familien, fungerer som en tumormarkør, reseptor og signalmolekyl via enzymavhengige og enzymuavhengige veier 1,2. I tillegg til å spalte de N-terminale aminosyrerester av forskjellige bioaktive peptider for regulering av deres biologiske aktivitet, spiller APN en viktig rolle i patogenesen av ulike inflammatoriske sykdommer. APN deltar i antigenbehandling og presentasjon av trimmede peptider som binder tett til store histokompatibilitetskompleks klasse II-molekyler 2,3. APN utøver også antiinflammatoriske effekter ved å binde seg til G-proteinkoblede reseptorer som deltar i multippel signaltransduksjon, modulerer cytokinsekresjon og bidrar til Fc gammareseptormediert fagocytose i immunresponsen 4,5,6,7.
Som en vidt distribuert membranbundet eksopeptidase er APN rikelig i svinens tynntarmslimhinne og er nært forbundet med reseptormediert endocytose 1,5,8. APN gjenkjenner og binder piggproteinet til det overførbare gastroenterittviruset for celleinngang, og interagerer direkte med FaeG-underenheten av enterotoksigene Escherichia coli F4 fimbriae for å påvirke bakteriell adherens med vertsceller 9,10,11. Dermed er APN et potensielt terapeutisk mål i behandlingen av virale og bakterielle infeksjonssykdommer.
Siden utviklingen av hybridoma-teknologi og andre strategier for monoklonale antistoffer (mAbs) produksjon i 1975, har mAbs blitt mye brukt i immunterapi, legemiddellevering og diagnose12,13,14. For tiden brukes mAbs med hell til å behandle sykdommer, som kreft, inflammatorisk tarmsykdom og multippel sklerose12,15. På grunn av deres sterke affinitet og spesifisitet kan mAbs være ideelle mål i utviklingen av antistoff-legemiddelkonjugater (ADC) eller nye vaksiner16,17. APN-proteinet er kritisk for selektivt å levere antigener til spesifikke celler, og kan fremkalle en spesifikk og sterk slimhinneimmunrespons mot patogener uten forstyrrelser, inkludert lavt proteinuttrykk, enzyminaktivitet eller strukturelle endringer 5,8,18. Derfor viser terapeutiske produkter basert på APN-spesifikke mAbs løfte mot bakterielle og virusinfeksjoner. I denne studien beskriver vi produksjon av APN-spesifikke mAbs ved hjelp av hybridoma-teknologi, og ekspresjon av anti-APN rekombinante antistoffer (rAbs) ved bruk av prokaryote og eukaryote vektorer. Resultatet indikerer at APN-proteinet ble gjenkjent av både rAbs uttrykt i pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-celler og hybridomavledede mAbs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Induksjon av slimhinneimmunitet er en av de mest effektive tilnærmingene for å motvirke patogener og i forebygging og behandling av ulike sykdommer. APN, et sterkt uttrykt membranbundet protein i tarmslimhinnen, er involvert i induksjon av adaptiv immunrespons og i reseptormediert viral og bakteriell endocytose 1,5,8. APN brukes som antigenpartikler i mange formater av antigenbelastning og vaksinelevering. Den orale administra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Chinese National Science Foundation Grant (nr. 32072820, 31702242), tilskudd fra Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) og Talents på høyt nivå fra Yangzhou University Scientific Research Foundation, et prosjekt grunnlagt av Priority Academic Program of Development Jiangsu High Education Institution.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient’s need. British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
