Produção de anticorpos monoclonais contra aminopeptidase N no epitélio da mucosa intestinal suína
Summary
A proteína de anticorpos recombinantes expressa em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e anticorpos monoclonais produzidos usando a tecnologia tradicional de hibridoma pode reconhecer e ligar-se à proteína N aminopeptidase suína (APN).
Abstract
A aminopeptidase N suína (PNA), uma metalopeptidase ligada à membrana abundantemente presente na mucosa do intestino delgado, pode iniciar uma resposta imune mucosa sem qualquer interferência, como baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais. Isso torna a APN uma candidata atraente no desenvolvimento de vacinas que visam seletivamente o epitélio da mucosa. Estudos anteriores mostraram que a PNA é uma proteína receptora tanto para Escherichia coli (E. coli) F4 enterotoxigênica quanto para o vírus da gastroenterite transmissível. Assim, a APN mostra-se promissora no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga ou novas vacinas baseadas em anticorpos específicos da APN. Neste estudo, comparamos a produção de anticorpos monoclonais específicos para APN (mAbs) usando a tecnologia tradicional de hibridoma e o método de expressão de anticorpos recombinantes. Nós também estabelecemos uma linhagem celular de ovário de hamster chinês (CHO) transfectada de forma estável usando pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN e uma cepa BL21(DE3) de expressão de E. coli abrigando o vetor pET28a (+)-rAbs-APN. Os resultados mostram que anticorpos expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO e mAbs produzidos usando hibridomas podem reconhecer e se ligar à proteína APN. Isso fornece a base para uma maior elucidação da função do receptor de APN para o desenvolvimento de terapêuticas direcionadas a diferentes epítopos específicos de APN.
Introduction
A aminopeptidase N (APN), enzima pertencente à família das metaloproteinases M1, atua como marcador, receptor e molécula sinalizadora tumoral por vias dependentes e independentes de enzimas 1,2. Além de clivar os resíduos de aminoácidos N-terminais de vários peptídeos bioativos para a regulação de sua atividade biológica, a PNA desempenha um papel importante na patogênese de várias doenças inflamatórias. A PNA participa do processamento e apresentação de antígenos por peptídeos aparados que se ligam firmemente a moléculas de classe II do complexo principal de histocompatibilidade 2,3. A PNA também exerce efeitos anti-inflamatórios ao se ligar a receptores acoplados à proteína G, participando de transdução de múltiplos sinais, modulando a secreção de citocinas e contribuindo para a fagocitose mediada pelo receptor gama Fc na resposta imune 4,5,6,7.
Como uma exopeptidase ligada à membrana amplamente distribuída, a PNA é abundante na mucosa do intestino delgado suíno e está intimamente associada à endocitose mediada por receptores 1,5,8. A PNA reconhece e liga a proteína spike do vírus da gastroenterite transmissível para entrada celular e interage diretamente com a subunidade FaeG das fímbrias F4 de Escherichia coli enterotoxigênicas para afetar a aderência bacteriana com as células hospedeiras 9,10,11. Assim, a PNA é um potencial alvo terapêutico no tratamento de doenças infecciosas virais e bacterianas.
Desde o desenvolvimento da tecnologia de hibridoma e outras estratégias para a produção de anticorpos monoclonais (mAbs) em 1975, os mAbs têm sido amplamente utilizados em imunoterapia, liberação de fármacos e diagnóstico12,13,14. Atualmente, os mAbs são utilizados com sucesso no tratamento de doenças, como câncer, doença inflamatória intestinal e esclerosemúltipla12,15. Devido à sua forte afinidade e especificidade, os mAbs podem ser alvos ideais no desenvolvimento de conjugados anticorpo-droga (ADC) ou novas vacinas16,17. A proteína APN é crítica para a entrega seletiva de antígenos a células específicas, podendo provocar uma resposta imune específica e forte da mucosa contra patógenos sem qualquer interferência, incluindo baixa expressão proteica, inatividade enzimática ou alterações estruturais 5,8,18. Portanto, produtos terapêuticos à base de mAbs específicos para APN mostram-se promissores contra infecções bacterianas e virais. Neste estudo, descrevemos a produção de mAbs específicos para APN usando tecnologia de hibridoma e a expressão de anticorpos recombinantes anti-APN (rAbs) usando vetores procarióticos e eucarióticos. O resultado indica que a proteína APN foi reconhecida tanto por rAbs expressos em células pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO quanto por mAbs derivados de hibridomas.
Protocol
Representative Results
Discussion
A indução da imunidade da mucosa é uma das abordagens mais eficazes no combate a patógenos e na prevenção e tratamento de várias doenças. A PNA, uma proteína ligada à membrana altamente expressa na mucosa intestinal, está envolvida na indução da resposta imune adaptativa e na endocitose viral e bacteriana mediada por receptores 1,5,8. A PNA é usada como particulada antigênica em muitos formatos de carregamento de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pela Bolsa da Fundação Nacional de Ciência da China (No. 32072820, 31702242), subsídios da Bolsa do Governo de Jiangsu para Estudos no Exterior (JS20190246) e Talentos de Alto Nível da Fundação de Pesquisa Científica da Universidade de Yangzhou, um projeto fundado pelo Programa Acadêmico Prioritário de Desenvolvimento da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
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