Продукция моноклональных антител, нацеленных на аминопептидазу N, в эпителии слизистой оболочки кишечника свиней
Summary
Белок рекомбинантных антител, экспрессируемый в клетках pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO, и моноклональные антитела, полученные с использованием традиционной гибридомной технологии, могут распознавать и связываться с белком N-аминопептидазы свиней (APN).
Abstract
Свиная аминопептидаза N (APN), связанная с мембраной металлопептидаза, в изобилии присутствующая в слизистой оболочке тонкой кишки, может инициировать иммунный ответ слизистой оболочки без каких-либо помех, таких как низкая экспрессия белка, неактивность ферментов или структурные изменения. Это делает APN привлекательным кандидатом при разработке вакцин, которые избирательно нацелены на эпителий слизистой оболочки. Предыдущие исследования показали, что APN является рецепторным белком как для энтеротоксигенной Escherichia coli (E. coli) F4, так и для трансмиссивного вируса гастроэнтерита. Таким образом, APN показывает перспективность в разработке конъюгатов антитело-лекарственное средство или новых вакцин на основе APN-специфических антител. В этом исследовании мы сравнили продукцию APN-специфических моноклональных антител (mAb) с использованием традиционной гибридомной технологии и метода экспрессии рекомбинантных антител. Мы также создали стабильно трансфицированную клеточную линию яичников китайского хомяка (CHO) с использованием pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN и штамма экспрессии E. coli BL21 (DE3), содержащего вектор pET28a (+)-rAbs-APN. Результаты показывают, что антитела, экспрессируемые в клетках pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO и mAb, продуцированных с использованием гибридом, могут распознавать и связываться с белком APN. Это обеспечивает основу для дальнейшего выяснения функции рецептора APN для разработки терапевтических средств, нацеленных на различные APN-специфические эпитопы.
Introduction
Аминопептидаза N (APN), фермент подработки, принадлежащий к семейству металлопротеиназ M1, действует как онкомаркер, рецептор и сигнальная молекула через ферментозависимые и ферментнезависимые пути 1,2. Помимо расщепления N-концевых аминокислотных остатков различных биологически активных пептидов для регуляции их биологической активности, АПН играет важную роль в патогенезе различных воспалительных заболеваний. APN участвует в процессинге и презентации антигена обрезанными пептидами, которые плотно связываются с основными молекулами комплекса гистосовместимости II класса 2,3. APN также оказывает противовоспалительное действие, связываясь с рецепторами, связанными с G-белком, участвующими в множественной передаче сигнала, модулирующими секрецию цитокинов и способствующими фагоцитозу, опосредованному гамма-рецептором Fc в иммунном ответе 4,5,6,7.
Как широко распространенная мембраносвязанная экзопептидаза, APN в изобилии присутствует в слизистой оболочке тонкой кишки свиньи и тесно связана с рецептор-опосредованным эндоцитозом 1,5,8. APN распознает и связывает спайковый белок трансмиссивного вируса гастроэнтерита для проникновения в клетки и напрямую взаимодействует с субъединицей FaeG энтеротоксигенных фимбрий Escherichia coli F4, влияя на бактериальную адгезию с клетками-хозяевами 9,10,11. Таким образом, АПН является потенциальной терапевтической мишенью при лечении вирусных и бактериальных инфекционных заболеваний.
С момента разработки гибридомной технологии и других стратегий производства моноклональных антител (mAb) в 1975 году мАТ широко используются в иммунотерапии, доставке лекарств и диагностике12,13,14. В настоящее время мАТ успешно используются для лечения таких заболеваний, как рак, воспалительные заболевания кишечника и рассеянный склероз12,15. Из-за их сильного сродства и специфичности мАТ могут быть идеальными мишенями при разработке конъюгатов антитело-лекарственное средство (АЦП) или новых вакцин16,17. Белок APN имеет решающее значение для селективной доставки антигенов в определенные клетки и может вызывать специфический и сильный иммунный ответ слизистой оболочки против патогенов без какого-либо вмешательства, включая низкую экспрессию белка, неактивность ферментов или структурные изменения 5,8,18. Таким образом, терапевтические продукты на основе APN-специфических мАТ показывают многообещающие результаты против бактериальных и вирусных инфекций. В этом исследовании мы описываем продукцию APN-специфических mAb с использованием гибридомной технологии и экспрессию анти-APN-рекомбинантных антител (rAb) с использованием прокариотических и эукариотических векторов. Результат указывает на то, что белок APN был распознан как rAb, экспрессируемыми в клетках pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO, так и mAb, полученными из гибридомы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Индукция иммунитета слизистой оболочки является одним из наиболее эффективных подходов в противодействии болезнетворным микроорганизмам, а также в профилактике и лечении различных заболеваний. APN, высокоэкспрессируемый мембраносвязанный белок в слизистой оболочке кишечника, участ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантом Китайского национального научного фонда (No 32072820, 31702242), грантами Стипендии правительства Цзянсу для зарубежных исследований (JS20190246) и Научно-исследовательским фондом «Таланты высокого уровня Университета Янчжоу», проектом, основанным Приоритетной академической программой развития высшего учебного заведения провинции Цзянсу.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient’s need. British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
