Domuz Bağırsak Mukozal Epitelinde Aminopeptidaz N'yi Hedef Alan Monoklonal Antikorların Üretimi
Summary
pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen rekombinant antikor proteini ve geleneksel hibridoma teknolojisi kullanılarak üretilen monoklonal antikorlar, domuz aminopeptidaz N (APN) proteinini tanıyabilir ve bağlanabilir.
Abstract
İnce bağırsak mukozasında bol miktarda bulunan membrana bağlı bir metallopeptidaz olan domuz aminopeptidaz N (APN), düşük protein ekspresyonu, enzim hareketsizliği veya yapısal değişiklikler gibi herhangi bir müdahale olmaksızın mukozal bir bağışıklık tepkisi başlatabilir. Bu, APN’yi mukozal epiteli seçici olarak hedef alan aşıların geliştirilmesinde çekici bir aday haline getirmektedir. Önceki çalışmalar, APN’nin hem enterotoksijenik Escherichia coli (E. coli) F4 hem de bulaşıcı gastroenterit virüsü için bir reseptör proteini olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, APN, antikor-ilaç konjugatlarının veya APN’ye özgü antikorlara dayanan yeni aşıların geliştirilmesinde umut vaat etmektedir. Bu çalışmada, APN’ye özgü monoklonal antikorların (mAbs) üretimini geleneksel hibridoma teknolojisi ve rekombinant antikor ekspresyon yöntemi kullanılarak karşılaştırdık. Ayrıca, pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN ve pET28a (+)-rAbs-APN vektörünü barındıran bir E. coli ekspresyonu BL21 (DE3) suşu kullanarak kararlı bir şekilde transfekte edilmiş bir Çin hamster yumurtalık (CHO) hücre hattı oluşturduk. Sonuçlar, pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde eksprese edilen antikorların ve hibridomlar kullanılarak üretilen mAbs’nin APN proteinini tanıyabileceğini ve bağlanabileceğini göstermektedir. Bu, farklı APN’ye özgü epitopları hedef alan terapötiklerin geliştirilmesi için APN reseptör fonksiyonunun daha fazla aydınlatılması için temel sağlar.
Introduction
Metalloproteinaz M1 ailesine ait bir ay ışığı enzimi olan Aminopeptidaz N (APN), enzime bağımlı ve enzimden bağımsız yollar1,2 aracılığıyla bir tümör belirteci, reseptör ve sinyal molekülü olarak işlev görür. APN, biyolojik aktivitelerinin düzenlenmesi için çeşitli biyoaktif peptitlerin N-terminal amino-asit kalıntılarını ayırmanın yanı sıra, çeşitli enflamatuar hastalıkların patogenezinde önemli bir rol oynamaktadır. APN, majör histokompatibilite kompleksi sınıf II molekülleri 2,3’e sıkıca bağlanan kesilmiş peptitler tarafından antijen işleme ve sunumuna katılır. APN ayrıca çoklu sinyal iletimine katılan G proteinine bağlı reseptörlere bağlanarak, sitokin sekresyonunu modüle ederek ve immün yanıtta Fc gama reseptörü aracılı fagositoza katkıda bulunarak anti-enflamatuar etkiler gösterir 4,5,6,7.
Yaygın olarak dağılmış membrana bağlı bir ekzopeptidaz olarak APN, domuz ince bağırsak mukozasında bol miktarda bulunur ve reseptör aracılı endositoz 1,5,8 ile yakından ilişkilidir. APN, hücre girişi için bulaşıcı gastroenterit virüsünün başak proteinini tanır ve bağlar ve konakçı hücrelerle bakteriyel uyumu etkilemek için enterotoksijenik Escherichia coli F4 fimbriae’nin FaeG alt birimi ile doğrudan etkileşime girer 9,10,11. Bu nedenle APN, viral ve bakteriyel enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde potansiyel bir terapötik hedeftir.
1975 yılında hibridoma teknolojisinin ve monoklonal antikorların (mAbs) üretimi için diğer stratejilerin geliştirilmesinden bu yana, mAbs immünoterapi, ilaç dağıtımı ve tanıda yaygın olarak kullanılmaktadır12,13,14. Şu anda, mAbs kanser, enflamatuar bağırsak hastalığı ve multipl skleroz gibi hastalıkları tedavi etmek için başarıyla kullanılmaktadır12,15. Güçlü afiniteleri ve özgüllükleri nedeniyle, mAb’ler antikor-ilaç konjugatlarının (ADC) veya yeni aşıların geliştirilmesinde ideal hedefler olabilir16,17. APN proteini, antijenleri spesifik hücrelere seçici olarak vermek için kritik öneme sahiptir ve düşük protein ekspresyonu, enzim hareketsizliği veya yapısal değişiklikler dahil olmak üzere herhangi bir müdahale olmaksızın patojenlere karşı spesifik ve güçlü bir mukozal bağışıklık tepkisi ortaya çıkarabilir 5,8,18. Bu nedenle, APN’ye özgü mAb’lere dayanan terapötik ürünler, bakteriyel ve viral enfeksiyonlara karşı umut vaat etmektedir. Bu çalışmada, hibridoma teknolojisi kullanılarak APN’ye özgü mAbs üretimi ve prokaryotik ve ökaryotik vektörler kullanılarak anti-APN rekombinant antikorların (rAbs) ekspresyonu anlatılmaktadır. Sonuç, APN proteininin hem pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO hücrelerinde hem de hibriddom türevi mAbs’de eksprese edilen rAbs tarafından tanındığını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mukozal immünitenin indüklenmesi, patojenlere karşı koymada ve çeşitli hastalıkların önlenmesinde ve tedavisinde en etkili yaklaşımlardan biridir. Bağırsak mukozasında yüksek oranda eksprese edilen membrana bağlı bir protein olan APN, adaptif immün yanıtın indüklenmesinde ve reseptör aracılı viral ve bakteriyel endositozda rol oynar 1,5,8. APN, antijen yüklemesi ve aşı dağıtımının birçok formatı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Çin Ulusal Bilim Vakfı Hibesi (No. 32072820, 31702242), Jiangsu Hükümeti Denizaşırı Çalışmalar Bursu (JS20190246) ve Yangzhou Üniversitesi Bilimsel Araştırma Vakfı’nın Üst Düzey Yetenekleri tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
- Chen, L., Lin, Y. L., Peng, G., Li, F. Structural basis for multifunctional roles of mammalian aminopeptidase N. Proceedings of the National Academy of Sciences of The United States Of America. 109 (44), 17966-17971 (2012).
- Mina-Osorio, P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target. Trends in Molecular Medicine. 14 (8), 361-371 (2008).
- Lu, C., Amin, M. A., Fox, D. A. CD13/Aminopeptidase N is a potential therapeutic target for inflammatory disorders. The Journal of Immunology. 204 (1), 3-11 (2020).
- Villaseñor-Cardoso, M. I., Frausto-Del-Río, D. A., Ortega, E. Aminopeptidase N (CD13) is involved in phagocytic processes in human dendritic cells and macrophages. BioMed Research International. 2013, 562984 (2013).
- Melkebeek, V., et al. Targeting aminopeptidase N, a newly identified receptor for F4ac fimbriae, enhances the intestinal mucosal immune response. Mucosal Immunology. 5 (6), 635-645 (2012).
- Morgan, R., et al. Expression and function of aminopeptidase N/CD13 produced by fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis: role of CD13 in chemotaxis of cytokine-activated T cells independent of enzymatic activity. Arthritis & Rheumatology. 67 (1), 74-85 (2015).
- Du, Y., et al. Angiogenic and arthritogenic properties of the soluble form of CD13. The Journal of Immunology. 203 (2), 360-369 (2019).
- Rasschaert, K., Devriendt, B., Favoreel, H., Goddeeris, B. M., Cox, E. Clathrin-mediated endocytosis and transcytosis of enterotoxigenic Escherichia coli F4 fimbriae in porcine intestinal epithelial cells. Veterinary Immunology and Immunopathology. 137 (3-4), 243-250 (2010).
- Reguera, J., et al. Structural bases of coronavirus attachment to host aminopeptidase N and its inhibition by neutralizing antibodies. PLoS Pathogens. 8 (8), 100859 (2012).
- Delmas, B., et al. Aminopeptidase N is a major receptor for the entero-pathogenic coronavirus TGEV. Nature. 357 (6377), (1992).
- Xia, P., et al. Porcine aminopeptidase N binds to F4+ enterotoxigenic Escherichia coli fimbriae. Veterinary Research. 47 (1), 24 (2016).
- Nakamura, R. M. Monoclonal antibodies: methods and clinical laboratory applications. Clinical Physiology and Biochemistry. 1 (2-5), 160-172 (1983).
- Chan, C. E., Chan, A. H., Lim, A. P., Hanson, B. J. Comparison of the efficiency of antibody selection from semi-synthetic scFv and non-immune Fab phage display libraries against protein targets for rapid development of diagnostic immunoassays. Journal of Immunological Methods. 373 (1-2), 79-88 (2011).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- El Miedany, Y. MABS: targeted therapy tailored to the patient’s need. British Journal of Nursing. 24 (16), 4-13 (2015).
- Castelli, M. S., McGonigle, P., Hornby, P. J. The pharmacology and therapeutic applications of monoclonal antibodies. Pharmacology Research & Perspectives. 7 (6), 00535 (2019).
- Weiner, G. J. Building better monoclonal antibody-based therapeutics. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).
- Bakshi, S., et al. Evaluating single-domain antibodies as carriers for targeted vaccine delivery to the small intestinal epithelium. Journal of Controlled Release. 321, 416-429 (2020).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. The Journal of Immunology. 174 (5), 2453-2455 (2005).
- Chen, W., Liu, W. E., Li, Y. M., Luo, S., Zhong, Y. M. Preparation and preliminary application of monoclonal antibodies to the receptor binding region of Clostridium difficile toxin B. Molecular Medicine Reports. 12 (5), 7712-7720 (2015).
- Levieux, D., Venien, A., Levieux, A. Epitopic analysis and quantification of bovine myoglobin with monoclonal antibodies. Hybridoma. 14 (5), 435-442 (1995).
- Zhou, M., et al. Flagellin and F4 fimbriae have opposite effects on biofilm formation and quorum sensing in F4ac+ enterotoxigenic Escherichia coli. Veterinary Microbiology. 168 (1), 148-153 (2014).
- Heinrich, L., Tissot, N., Hartmann, D. J., Cohen, R. Comparison of the results obtained by ELISA and surface plasmon resonance for the determination of antibody affinity. Journal of Immunological Methods. 352 (1-2), 13-22 (2010).
- Vander Weken, H., Cox, E., Devriendt, B. Advances in oral subunit vaccine design. Vaccines. 9, 1 (2020).
- Baert, K., et al. β-glucan microparticles targeted to epithelial APN as oral antigen delivery system. Journal of Controlled Release. 220, 149-159 (2015).
- Neuberger, M. S., Williams, G. T., Fox, R. O. Recombinant antibodies possessing novel effector functions. Nature. 312 (5995), 604-608 (1984).
