Ein Ratten-Lungentransplantationsmodell für warme Ischämie/Reperfusionsschäden: Optimierungen zur Verbesserung der Ergebnisse
Summary
Hier stellen wir Optimierungen an einem Rattenlungentransplantationsmodell vor, die dazu dienen, die Ergebnisse zu verbessern. Wir bieten eine Größentabelle für Manschetten basierend auf dem Körpergewicht, eine Messstrategie zur Bestimmung des 4. Interkostalraums sowie Methoden des Wundverschlusses und der BAL-Flüssigkeit (bronchoalveoläre Lavage) und Gewebeentnahme.
Abstract
Aus unserer Erfahrung mit der Lungentransplantation von Ratten haben wir mehrere Bereiche mit Verbesserungspotenzial gefunden. Die Informationen in der vorhandenen Literatur über Methoden zur Auswahl geeigneter Manschettengrößen für die Pulmonalvene (PV), die Pulmonalarterie (PA) oder den Bronchus (Br) sind vielfältig, so dass die Bestimmung der richtigen Manschettengröße während der Rattenlungentransplantation eine Übung von Versuch und Irrtum ist. Durch die Standardisierung der Cuffing-Technik, um die kleinste effektive Manschette zu verwenden, die für die Größe des Gefäßes oder Bronchus geeignet ist, kann man das Transplantationsverfahren sicherer, schneller und erfolgreicher machen. Da die Durchmesser von PV, PA und Br mit dem Körpergewicht der Ratte zusammenhängen, stellen wir eine Strategie zur Auswahl einer geeigneten Größe unter Verwendung eines gewichtsbasierten Leitfadens vor. Da das Lungenvolumen auch mit dem Körpergewicht zusammenhängt, empfehlen wir, dass dieser Zusammenhang auch bei der Auswahl des richtigen Luftvolumens für das Aufblasen der Spenderlunge während einer warmen Ischämie sowie für das richtige PBS-Volumen, das während der Entnahme von bronchoalveolärer Lavageflüssigkeit (BAL) instilliert werden soll, berücksichtigt werden sollte. Wir beschreiben auch Methoden für die 4. Interkostalraumdissektion, den Wundverschluss und die Probenentnahme sowohl aus dem nativen als auch aus dem transplantierten Lappen.
Introduction
Seit über drei Jahrzehnten modifizieren und verbessern Forscher Rattenlungentransplantationsmodelle, damit die generierten Daten konsistenter sind und den tatsächlichen klinischen Zustand besser widerspiegeln. In der Zeit, in der unser Labor dieses Modell durchführte, haben wir vier Bereiche mit Verbesserungspotenzial festgestellt: Cuffing-Techniken für Anastomosen, Identifizierung des 4. Interkostalraums des Empfängers, Aufblasen und Wundverschluss der Lunge während des Eingriffs des Empfängers sowie die Entnahme von Proben für die Analyse.
Modifikationen der Cuffing-Technik für Anastomosen können den gesamten Transplantationsprozess verbessern, indem sie die Handhabungszeit der Spenderlungeverkürzen 1,2,3,4,5,6 und das Anastomosenverfahren für den Mikrochirurgen schneller und technisch einfacher machen. Während es wichtig ist, Manschetten in der richtigen Größe zu verwenden, um die transplantierte Lunge mit dem notwendigen Blut und Luftstrom zu versorgen, gibt es nur begrenzte Richtlinien darüber, wie man die Größe der Manschetten für die Pulmonalvene (PV), die Pulmonalarterie (PA) oder den Bronchus (Br) auswählen sollte5,7,8,9. Da die Durchmesser von PV, PA und Br mit dem Körpergewicht der Spender- und Empfängerratten zusammenhängen, schlagen wir vor, dass die Manschettengröße auf dem Körpergewicht basiert. Dieser Bericht enthält eine Größentabelle für Manschetten basierend auf dem Körpergewicht einer Ratte (180 g bis über 270 g), die dazu dient, die Blut- und Luftversorgung der transplantierten Lunge zu optimieren (Tabelle 1).
Während ein neuerer Mikrochirurg während des Spenderverfahrens erfolgreich und einfach eine Spenderlunge beschaffen kann, ist die Transplantation der Lunge während des Eingriffs des Empfängers komplizierter und hängt von der Erfahrung des Mikrochirurgen ab. Der Versuch, den 4. Interkostalraum zu finden, um Zugang zur linken Lunge des Empfängers zu erhalten, ist einer der schwierigeren Schritte, der eine gewisse Subjektivität aufweist und die Eingriffszeit verlängern kann. Daher stellen wir eine einfache und objektive Methode vor, um die Identifizierung der 4. Interkostalraumlokalisation zu unterstützen, indem wir Brustmessungen und das Herzklopfen verwenden, um den richtigen Bereich der Brustwand zu finden, um 4,5,6,10,11,12 zu präparieren.
Wir schlagen auch eine Verbesserung der Vergrößerung der Spenderlunge vor, die eine potenzielle Ursache für die Schädigung des Organs darstellt. Die Spenderlunge wird entleert, bis die Reperfusion beginnt. Beim Nähen des 4. Zwischenrippenraums wird die Spenderlunge häufig durch Erhöhung des PEEP von 2 cmH2 O auf 6cmH2O aufgebläht. Um die Lungenschädigung durch Überpumpen zu minimieren, schlagen wir eine Technik vor, bei der drei 6-0-Nylonnähte mit einfachen Doppelknoten um die 4. Rippe unterhalb der 5. Rippe gelegt werden. Wenn es Zeit für den Wundverschluss ist, werden die Enden der drei Nähte mit Hämostaten in beiden Händen gehalten, die Wunde wird auf einmal geschlossen, indem auf jeder Seite nach oben gezogen wird, und der PEEP wird sofort auf 2cmH2O reduziert. Auf diese Weise kann sich die Lunge so kurz wie möglich ausdehnen10.
Am Ende eines Experiments möchte der Forscher oft viele Arten von Proben für viele Arten von Analysen von jedem Transplantat sammeln. Zum Beispiel können eingefrorenes Gewebe, formalinfixiertes Gewebe, Gewebe für das Nass-Trocken-Gewichtsverhältnis zur Bestimmung des Lungenödems und bronchoalvelolare Lavageflüssigkeit (BAL) verwendet werden, um zu beurteilen, wie gut das Transplantat verlaufen ist. Die traditionelle Methode der Entnahme von BAL-Flüssigkeit ermöglicht eine gemischte Probe sowohl aus den nativen Lappen des Empfängers als auch aus dem transplantierten Lappen des Spenders13,14,15. Um dies zu überwinden, stellen wir eine Methode zur Klemmung der Hilarbereiche vor, die einen genaueren Einblick in den Zustand der transplantierten und nativen Lunge geben kann. Darüber hinaus ist es wichtig, das PBS-Volumen zu berücksichtigen, das zum Auffangen von BAL-Flüssigkeit auf jeder Seite der Lunge verwendet wird, da die BAL-Flüssigkeit zahlreiche lösliche Faktoren wie Zytokine und Chemokine enthält, die anhand der Konzentration gemessen werden. Die Normalisierung des Volumens der eingeträuselten Flüssigkeit auf das geschätzte Volumen der Lungenkapazität kann beim Vergleich helfen. Mit vier Lappen auf der rechten Seite und einem Lappen auf der linken Seite hat jeder der fünf Lappen der Ratte ein anderes Volumen und eine andere Oberfläche16. Nach einer früheren Studie zur Volumenmessung von Lungenlappen von Backer et al. beträgt das Volumen des rechten Lappens 63% (4400 mm 3) und des linken Lappens 37% (2500 mm3). Daher empfehlen wir, das PBS-Volumen, das zum Auffangen von BAL-Flüssigkeit verwendet wird, als das Doppelte des Tidalvolumens (7,2 ml/kg) multipliziert mit 63 % für die rechte Lunge und 37 % für die linke Lunge zu berechnen. Mit diesem Ansatz kann man Variablen wie Körpergewicht und Timingbesser kontrollieren 10,16.
Insgesamt werden wir in diesem Bericht einige Modifikationen des experimentellen Standardmodells der Rattenlungentransplantation demonstrieren, die das Verfahren effizienter machen und die Fähigkeit erhöhen können, genauere und reichhaltigere Daten aus jedem Experiment zu generieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Bericht haben wir an mehreren kritischen Schritten eines Rattenlungentransplantationsprotokolls interveniert, um das Verfahren zu optimieren. Obwohl über verschiedene Cuffing-Techniken für die Lungentransplantation von Ratten berichtet wurde 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15<su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nichts.
Materials
| 12 Gauge angio-catheter | BD | 382277 | |
| 14 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251717-02 | |
| 16 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252586-02 | |
| 18 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4251679-02 | |
| 20 Gauge angio-catheter | B. Braun | 4252527-02 | |
| 4-0 silk suture | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| 6-0 nylon suture | AD Surgical | S-N618R13 | |
| 7-0 nylon suture | AD Surgical | S-N718SP13 | |
| 8-0 nylon suture | AD Surgical | XXS-N807T6 | |
| Betadine Spray | Avrio Health L.P | UPC 367618160039 | |
| Clippers | VWR | MSPP-023326 | |
| Castroviejo micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instrument Co | RS-5668 | |
| Dumont #5 – Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Electrocautery | Macan | MV-7A | |
| Endotracheal intubation kit | Kent Scientific | ETI-MSE | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Halsted-mosquito hemostat | Roboz Surgical Instrument Co | RS-7112 | |
| Heparin | Fresnius Medical Care | C504701 | |
| Insulin syringe | Life Technologies | B328446 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropyl Alcohol Swabs | BD | 326895 | |
| Ketamine | Hikma Pharmaceuticals PLC | NDC 0413-9505-10 | |
| Dieffenbach Bulldog Clamp | World Precision Instruments | WPI14117 | |
| Needle holder/Forceps, Curved | Micrins | MI1542 | |
| Needle holder/Forceps, Straight | Micrins | MI1540 | |
| Perfadex Plus (Organ Preservation Solution) | XVIVO Perfusion AB | REF# 19950 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | Used to check SpO2 and heartbeat |
| Retractor | Roboz Surgical Instrument Co | RS-6560 | |
| Saline | PP Pharmaceuticals LLC | NDC 63323-186-10 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| Sterile Cotton Gauze Pad | Fisherbrand | 22-415-469 | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Syringe 5mL | BD | 309646 | |
| Vannas-Tubingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | |
| Xylazine | Korn Pharmaceuticals Corp | NDC 59399-110-20 | |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT351T | Used to clamp bronchus |
| Yasargil Clamp | Aesculap, Inc | FT261T | Used to clamp hilum |
| Yasargil Clamp Applicator | Aesculap, Inc | FT484T |
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