שיטה פשוטה ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת אורגנואידים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs). פרוטוקול זה מייצר אורגנואידים בכליות תוך שבועיים. האורגנואידים של הכליות המתקבלים יכולים להיות מתורבתים בבקבוקי ספינר בקנה מידה גדול או בלוחות ערבוב מגנטיים מרובי בארות עבור גישות מקבילות לבדיקת סמים.
Abstract
אורגנואידים של כליות שנוצרו מ-hPSCs סיפקו מקור בלתי מוגבל של רקמת כליה. אורגנואידים של כליות אנושיות הם כלי רב ערך לחקר מחלות כליות ופציעות, לפיתוח טיפולים מבוססי תאים ולבדיקת טיפולים חדשים. עבור יישומים כאלה, יש צורך במספר רב של אורגנואידים אחידים ומבחנים הניתנים לשחזור. בנינו על פרוטוקול האורגנואידים הכליתי שפורסם בעבר כדי לשפר את הבריאות הכללית של האורגנואידים. פרוטוקול תלת-ממדי פשוט וחזק זה כולל היווצרות של גופים עובריים אחידים במדיום רכיב מינימלי המכיל שומנים, תוסף אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין ואלכוהול פוליוויניל עם מעכב GSK3 (CHIR99021) למשך 3 ימים, ולאחר מכן תרבית במדיום המכיל תחליף סרום נוק-אאוט (KOSR). בנוסף, בדיקות תסיסה מאפשרות הפחתה בהתגוששות של הגוף העוברי ושמירה על גודל אחיד, החשוב לצמצום השונות בין האורגנואידים. בסך הכל, הפרוטוקול מספק שיטה מהירה, יעילה וחסכונית ליצירת כמויות גדולות של אורגנואידים בכליות.
Introduction
בשנים האחרונות פותחו מספר פרוטוקולים להבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לאורגנואידים בכליות 1,2,3,4,5. אורגנואידים של כליות סיפקו כלי חשוב כדי לסייע למחקר בגישות חדשות לרפואה רגנרטיבית, מודל מחלות הקשורות לכליות, ביצוע מחקרי רעילות ופיתוח תרופות טיפוליות. למרות תחולתם הרחבה, לאורגנואידים בכליות יש מגבלות כגון חוסר התבגרות, יכולת תרבית מוגבלת לטווח ארוך במבחנה, ומחסור במספר סוגי תאים המצויים בכליה האנושית 6,7,8. העבודה האחרונה התמקדה בשיפור רמת ההבשלה האורגנואידית, הארכת תקופות התרבית והרחבת המורכבות של אוכלוסיות תאי הכליה על ידי שינוי הפרוטוקולים הקיימים 9,10,11,12. באיטרציה הנוכחית של הפרוטוקול שנקבע עלידינו 5,13, שינינו את הרכיבים הבינוניים בשלב הראשון של הפרוטוקול למדיום בסיס נטול סרום בתוספת אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין (ITSE), שומנים, אלכוהול פוליוויניל (E5-ILP) ו-CHIR99021 (איור 1). שינויים אלה מספקים מדיום מוגדר לחלוטין, נטול סרום ודל חלבון, עם פחות רכיבים מהרכב הבינוני הקודם שלנו 5,13 וללא גורמי גדילה נוספים. כתוצאה מכך, מדיום השלב הראשון הוא פחות עתיר עבודה להכנה מאשר הגרסה שלנו שפורסמה בעבר, ועשוי להפחית את השונות בין אצווה לאצווה5. מחקרים קודמים הראו שגם אינסולין וגם טרנספרין חשובים בתרבית ללא סרום14,15, אולם רמות גבוהות של אינסולין יכולות להיות מעכבות להתמיינות מזודרם16. שמרנו על רמות האינסולין הנמוכות כפי שנקבעו בפרוטוקול המקורי, והפחתנו עוד יותר את רמות ה-KOSR (המכיל אינסולין) בשלב השני של הבדיקה. בהתאם לפרוטוקולים אחרים להיווצרות אורגנואידים בכליות, רמות נמוכות יותר של KOSR מועילות לשמירה על איזון בין התפשטות והתמיינות של רקמת הכליה17. בנוסף, הורדנו את ריכוז הגלוקוז במדיום שלב IIשלנו 13.
השיטה שלנו מתארת התקנה לבדיקת תרחיף של אורגנואידים בכליות, המניבה עד כ-1,000 אורגנואידים מלוח תרבית ראשוני של כ-60% hPSC 100 מ”מ, כפי שתואר בפרסום המקורי 5,13. ניתן לשנות את קנה המידה של פרוטוקול זה בקלות עד כדי התחלה עם מספר לוחות 100 מ”מ או 150 מ”מ כדי להגדיל עוד יותר את מספר האורגנואידים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים קודמים הראו כי שלבי הפרוטוקול הראשוניים הם קריטיים עבורהתמיינות מזודרם ביניים 5,19,20, ולכן חיוני ליישם הרכב בינוני מחמיר בשלב זה. הסרת רכיבים לא מוגדרים כגון סרום, אלבומין, הכלאה נטולת חלבון מדיום II מהשלב הראשון של הפרוטוקול עשויה ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות R01 DK069403, UC2 DK126122 ו- P30-DK079307 וקרן ASN לחקר הכליות תוכנית עמיתי המחקר של בן ג’יי ליפס ל- AP.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Thermo Fisher | 21-985-023 | |
| Anti-adherence rinsing solution | STEMCELL Technologies | 7010 | |
| CHIR99021 | STEMCELL Technologies | 72054 | 10 mM stock in DMSO |
| Corning disposable spinner flasks | Fisher Scientific | 07-201-152 | |
| Corning Ultra-Low Attachment 6-well plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Corning Slow-Speed Stirrers | Fisher Scientific | 11-495-03 | Multi plate magnetic stirrer for spinner flask culture |
| Dispase | STEMCELL Technologies | 7923 | Aliquot and freeze |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 | |
| DPBS 1x, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher | 14-190-250 | |
| Egg / Oval Stirring Bars | 2mag | PI20106 | |
| Excelta General-Purpose Tweezers | Fisher Scientific | 17-456-103 | Keep sterile in the cell culture hood |
| EZBio Single Use Media Bottle, 250mL | Foxx Life Sciences | 138-3211-FLS | Used to make PVA 10% |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm) | Thermo Fisher | 08-772E | |
| Fisherbrand Sterile Aspirating Pipet 2mL | Fisher Scientific | 14-955-135 | |
| Fisherbrand Cell Lifters – Cell lifter | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Fisherbrand Multi Function 3D Rotators | Fisher Scientific | 88-861-047 | Orbital shaker |
| Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix | Thermo Fisher | A1413302 | BME. Aliquot on ice and freeze. Another suitable matrix alternative is Matrigel or Cultrex. |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | GCDR |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35-050-061 | L-glutamine supplement. |
| HEPES (1M) | Thermo Fisher | 15-630-080 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine | Thermo Fisher | 51-500-056 | ITSE |
| KnockOut Serum Replacement – Multi-Species | Thermo Fisher | A3181502 | KOSR. Aliquot and freeze |
| Lipid Mixture 1, Chemically Defined | Millipore-Sigma | L0288-100ML | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL | Fisher Scientific | S2GPU05RE | |
| MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL | Fisher Scientific | S2GPU02RE | |
| MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit | 2mag | VMF 90250 U | |
| MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive | 2mag | VMF 40600 | 6MSP |
| MP Biomedicals 7X Cleaning Solution | Fisher Scientific | MP0976670A4 | Tissue culture suitable detergent. Make a 5% solution in water |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | hPSC medium.TeSR-E8, NutriStem XF, and mTeSR Plus medium have also been tested and are suitable alternatives. |
| Nunc 50 mL Conical, Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Nunc 15mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 12-565-268 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15-140-122 | Aliquot and freeze |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt | Anti-mycoplasma reagent. Aliquot and freeze |
| pluriStrainer® 200 µm | Fisher Scientific | NC0776417 | Cell strainer |
| pluriStrainer® 500 µm | Fisher Scientific | NC0822591 | Cell strainer |
| Poly(vinyl alcohol) 87-90% hydrolyzed (PVA) | Millipore-Sigma | P8136-250G | 10% in DPBS stirring at 98 degrees C until disolves, make in 138-3211-FLS |
| ROCK inhibitor Y-27632 (ROCKi) | STEMCELL Technologies | 72304 | 10 mM stock in DPBS |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 10mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Sterile Disposable Serological Pipets – 25mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Sterile Disposable Serological pipette – 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-12D | |
| TeSR-E5 | STEMCELL Technologies | 5916 | Serum-free, low protein base medium for E5-ILP |
| Variomag distriBOX 2 Distributor | 2mag | VMF 90512 | If you use more than one MIXdrive |
References
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).
- Przepiorski, A., et al. A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communication. 6, 8715 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Taguchi, A., Nishinakamura, R. Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Howden, S. E., Little, M. H. Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions. Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).
- Tanigawa, S., et al. Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors. Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).
- Sander, V., et al. Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells. STAR Protocols. 1 (3), 100150 (2020).
- Ekblom, P., Thesleff, I., Miettinen, A., Saxen, L. Organogenesis in a defined medium supplemented with transferrin. Cell Differentiation. 10 (5), 281-288 (1981).
- Thesleff, I., Ekblom, P. Role of transferrin in branching morphogenesis, growth and differentiation of the embryonic kidney. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 82, 147-161 (1984).
- Freund, C., et al. Insulin redirects differentiation from cardiogenic mesoderm and endoderm to neuroectoderm in differentiating human embryonic stem cells. Stem Cells. 26 (3), 724-733 (2008).
- Nishikawa, M., et al. An optimal serum-free defined condition for in vitro culture of kidney organoids. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 501 (4), 996-1002 (2018).
- Oh, J. K., et al. Derivation of induced pluripotent stem cell lines from New Zealand donors. Journal of the Royal Society of New Zealand. , 1-14 (2020).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2013).
- Lam, A. Q., et al. Rapid and efficient differentiation of human pluripotent stem cells into intermediate mesoderm that forms tubules expressing kidney proximal tubular markers. Journal of American Society of Nephrology. 25 (6), 1211-1225 (2014).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).
- Imasawa, T., et al. High glucose repatterns human podocyte energy metabolism during differentiation and diabetic nephropathy. FASEB Journal. 31 (1), 294-307 (2017).
- Kim, K. A., et al. High glucose condition induces autophagy in endothelial progenitor cells contributing to angiogenic impairment. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 37 (7), 1248-1252 (2014).
- Piwkowska, A., Rogacka, D., Audzeyenka, I., Jankowski, M., Angielski, S. High glucose concentration affects the oxidant-antioxidant balance in cultured mouse podocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 112 (6), 1661-1672 (2011).
- Wu, H., et al. Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics. Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).
- Lei, X., Deng, Z., Duan, E. Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor. Methods in Molecular Biology. , (2016).
