Undersøke fagocytose av Leishmania ved hjelp av konfokal mikroskopi
Summary
Mekanismen forbundet med fagocytose ved Leishmania-infeksjon er fortsatt dårlig forstått. Her beskriver vi metoder for å evaluere de tidlige hendelsene som oppstår under Leishmania-interaksjon med vertscellene.
Abstract
Fagocytose er en orkestrert prosess som involverer forskjellige trinn: anerkjennelse, binding og internalisering. Profesjonelle fagocytter tar opp Leishmania-parasitter ved fagocytose, bestående av å gjenkjenne ligander på parasittoverflater av flere vertscellereseptorer. Binding av Leishmania til makrofagmembraner skjer gjennom komplementreseptortype 1 (CR1) og komplementreseptor type 3 (CR3) og mønstergjenkjenningsreseptorer. Lipofosfoglykan (LPG) og 63 kDa glykoprotein (gp63) er de viktigste ligandene som er involvert i makrofag-Leishmania-interaksjoner . Etter den første anerkjennelsen av parasittligander av vertscellereseptorer, blir parasitter internalisert, overlever og multipliserer innenfor parasitoforøse vakuoler. Modningsprosessen av Leishmani-induserte vakuoler innebærer oppkjøp av molekyler fra intracellulære vesikler, inkludert monomer G-protein Rab 5 og Rab 7, lysosomalt assosiert membranprotein 1 (LAMP-1), lysosomalt assosiert membranprotein 2 (LAMP-2) og mikrotubuliassosiert protein 1A / 1B-lettkjede 3 (LC3).
Her beskriver vi metoder for å evaluere de tidlige hendelsene som oppstår under Leishmania-interaksjon med vertscellene ved hjelp av konfokal mikroskopi, inkludert (i) bindende (ii) internalisering og (iii) fagosommodning. Ved å legge til kunnskapsgrunnlaget rundt disse determinantene for infeksjonsutfall, håper vi å forbedre forståelsen av patogenesen av Leishmania-infeksjon og støtte det eventuelle søket etter nye kjemoterapeutiske mål.
Introduction
Leishmaniasis er en forsømt tropisk sykdom forårsaket av protozoa parasitter av slekten Leishmania, noe som resulterer i et bredt spekter av kliniske manifestasjoner i vertebratverten, inkludert kutan leishmaniasis, mukokutan leishmaniasis og visceral leishmaniasis1. Verdens helseorganisasjon (WHO) anslår at over en milliard mennesker er i faresonen, med mer enn en million nye tilfeller rapportert per år2.
Leishmania spp. er obligatoriske intracellulære protozoer som overlever inne i vertsceller, inkludert monocytter, makrofager og dendrittiske celler3. Leishmania-makrofaginteraksjon er en kompleks prosess som involverer flere vertscellereseptorer og parasittligander enten gjennom direkte interaksjon eller ved opsonisering som involverer komplementreseptorer 4,5. Klassiske overflatereseptorer, som CR1, CR3, mannose-fucose, fibronektin, tolllignende og scavenger reseptorer, formidler parasittfeste til makrofager 6,7,8. Disse reseptorene gjenkjenner molekyler på overflaten av Leishmania, inkludert 63 kDa glykoprotein (gp63) og glykolipid lipofosfoglykan (LPG)9. Dette er de mest tallrike molekylene på overflaten av promastigoter og spiller en viktig rolle i undergravingen av vertsimmunrespons, og favoriserer etableringen av parasittinfeksjon i pattedyrceller10. Etter at parasittoverflateligander binder seg til makrofagreseptorer, akkumuleres F-aktin på pattedyrcelleoverflater, som omgir parasitter når de fagocytoseres. Deretter fører dette til dannelsen av et parasittindusert rom kalt parasitophorøs vakuol (PV), som presenterer fagolysosomale egenskaper11. En gang inne i disse fagolysosomene gjennomgår parasitter flere endringer som er avgjørende for overlevelse og multiplikasjon3.
Biogenesen av PVs er en sterkt regulert membranhandelsprosess som er kritisk for den intracellulære overlevelsen av dette patogenet12. Dannelsen av dette rommet skyldes sekvensielle fusjonshendelser mellom fagosomer og rom i vertens endocytiske vei. Klassiske cellebiologiske studier har vist at modning av PVer innebærer oppkjøp av monomere G-protein Rab 5 og Rab 7 proteiner, som hovedsakelig er assosiert med henholdsvis tidlig og sen endosommodning, henholdsvis13. I tillegg får disse rommene lysosomassosierte membranproteiner 1 og 2 (LAMP 1, LAMP 2), de viktigste proteinbestanddelene i lysosomalmembranen og mikrotubuliassosiert protein 1A / 1B-lyskjede 3 (LC3), en autofagosommarkør14. Til tross for tilsynelatende likheter, varierer kinetikken til PV-dannelse15,16 og morfologien til disse rommene avhengig av Leishmania-arter. For eksempel induserer infeksjon forårsaket av L. mexicana eller L. amazonensis dannelsen av store rom som inneholder et stort antall parasitter17. Derimot danner andre arter, som L. braziliensis og L. infantum, mindre vakuoler som normalt bare inneholder en eller to parasitter i hver vacuole18.
Til tross for denne kunnskapen rundt vertscelle-Leishmania-interaksjon, har de første hendelsene utløst av kontakt mellom vertsreseptorer og parasittligander ikke blitt fullstendig belyst. Disse hendelsene er kjent for å være determinanter for utfallet av parasittinfeksjon og er avhengige av parasittarter, typen vertscellereseptorer rekruttert for å gjenkjenne parasitter og aktiveringen av makrofagsignalveier19,20. Derfor er det viktig å identifisere molekylene som er involvert i biogenesen av Leishmania-induserte PV-er og bestemme rollen (e) som disse molekylene spiller i infeksjonsetablering og utfall. Her beskriver vi en metode for å overvåke tidlige hendelser under fagocytose av Leishmania, inkludert binding, internalisering, fagosomdannelse og modning. Dette arbeidet kan bidra til å avklare deltakelsen av PLC, Akt, Rab5, Rab7 og LC3 i dannelsen av PVer indusert av forskjellige Leishmania-arter. Det er viktig at denne protokollen kan brukes til å undersøke deltakelsen av andre proteiner involvert i PV-modning. Fremtidige studier vil utvide kunnskapen om mekanismer involvert i Leishmania-vertscelleinteraksjon og bidra til utformingen av nye kjemoterapeutiske strategier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leishmania-makrofag interaksjon er en kompleks prosess og involverer flere trinn som kan påvirke sykdomsutvikling5. For bedre å forstå mekanismene som er involvert i samspillet mellom uopsonisert Leishmania og vertsceller, har vi beskrevet en protokoll som benytter konfokal fluorescensmikroskopi for å vurdere fagocytose fra tidlige til sene stadier av Leishmania-infeksjon . Bruken av fluorescensteknikker som involverer to eller flere fluoroforer for å undersøke cel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Gonçalo Moniz-instituttet, Fiocruz Bahia, Brasil og mikroskopiavdelingen for hjelp. Dette arbeidet ble støttet av INOVA-FIOCRUZ nummer 79700287000, PSTV har et stipend for produktivitet i forskning fra CNPq (305235/2019-2). Plasmider ble vennlig levert av Mauricio Terebiznik, University of Toronto, CA. Forfatterne vil gjerne takke Andris K. Walter for engelskspråklig revisjon og manuskriptredigering.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 antibody | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Red (CMTPX) Dye | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrífuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacin | Isofarma | X | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Confocal fluorescence microscope (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Fluorescence microscope (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N- 2-hydroxyethyl piperazine-N’-2-ethane-sulfonic acid) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | |
| Nucleofector solution | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Phorbol myristate acetate (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider's Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
References
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1 (2010).
- Alexander, J., Russell, D. G. The interaction of Leishmania species with macrophages. Advances in Parasitology. 31, 175-254 (1992).
- Mosser, D. M., Rosenthal, L. A. Leishmania-macrophage interactions: multiple receptors, multiple ligands and diverse cellular responses. Seminars in Cell Biology. 4 (5), 315-322 (1993).
- Awasthi, A., Mathur, R. K., Saha, B. Immune response to Leishmania infection. Indian Journal of Medical Research. 119 (6), 238-258 (2004).
- Blackwell, J. M. Role of macrophage complement and lectin-like receptors in binding Leishmania parasites to host macrophages. Immunology Letters. 11 (3-4), 227-232 (1985).
- Mosser, D. M., Edelson, P. J. The mouse macrophage receptor for C3bi (CR3) is a major mechanism in the phagocytosis of Leishmania promastigotes. Journal of Immunology. 135 (4), 2785-2789 (1985).
- Gough, P. J., Gordon, S. The role of scavenger receptors in the innate immune system. Microbes and Infection. 2 (3), 305-311 (2000).
- Russell, D. G., Wilhelm, H. The involvement of the major surface glycoprotein (gp63) of Leishmania promastigotes in attachment to macrophages. Journal of Immunology. 136 (7), 2613-2620 (1986).
- Handman, E., Goding, J. W. The Leishmania receptor for macrophages is a lipid-containing glycoconjugate. EMBO J. 4 (2), 329-336 (1985).
- Holm, A., Tejle, K., Magnusson, K. E., Descoteaux, A., Rasmusson, B. Leishmania donovani lipophosphoglycan causes periphagosomal actin accumulation: correlation with impaired translocation of PKCalpha and defective phagosome maturation. Cellular Microbiology. 3 (7), 439-447 (2001).
- Vergne, I., et al. Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (11), 4033-4038 (2005).
- Courret, N., Lang, T., Milon, G., Antoine, J. C. Intradermal inoculations of low doses of Leishmania major and Leishmania amazonensis metacyclic promastigotes induce different immunoparasitic processes and status of protection in BALB/c mice. International Journal for Parasitology. 33 (12), 1373-1383 (2003).
- Gutierrez, M. G., et al. Autophagy induction favours the generation and maturation of the Coxiella-replicative vacuoles. Cellular Microbiology. 7 (7), 981-993 (2005).
- Dermine, J. F., Scianimanico, S., Prive, C., Descoteaux, A., Desjardins, M. Leishmania promastigotes require lipophosphoglycan to actively modulate the fusion properties of phagosomes at an early step of phagocytosis. Cellular Microbiology. 2 (2), 115-126 (2000).
- Desjardins, M., Descoteaux, A. Inhibition of phagolysosomal biogenesis by the Leishmania lipophosphoglycan. Journal of Experimental Medicine. 185 (12), 2061-2068 (1997).
- Antoine, J. C., Prina, E., Lang, T., Courret, N. The biogenesis and properties of the parasitophorous vacuoles that harbour Leishmania in murine macrophages. Trends in Microbiology. 6 (10), 392-401 (1998).
- Alexander, J., et al. An essential role for IL-13 in maintaining a non-healing response following Leishmania mexicana infection. European Journal of Immunology. 32 (10), 2923-2933 (2002).
- Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual Review of Immunology. 17, 593-623 (1999).
- Olivier, M., Gregory, D. J., Forget, G. Subversion mechanisms by which Leishmania parasites can escape the host immune response: a signaling point of view. Clinical Microbiology Reviews. 18 (2), 293-305 (2005).
- English, D., Andersen, B. R. Single-step separation of red blood cells. Granulocytes and mononuclear leukocytes on discontinuous density gradients of Ficoll-Hypaque. Journal of Immunology Methods. 5 (3), 249-252 (1974).
- Petersen, A. L., et al. 17-AAG kills intracellular Leishmania amazonensis while reducing inflammatory responses in infected macrophages. PLoS One. 7 (11), 49496 (2012).
- Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Berges, R., et al. End-binding 1 protein overexpression correlates with glioblastoma progression and sensitizes to Vinca-alkaloids in vitro and in vivo. Oncotarget. 5 (24), 12769-12787 (2014).
- Franco, L. H., et al. The Ubiquitin Ligase Smurf1 Functions in Selective Autophagy of Mycobacterium tuberculosis and Anti-tuberculous Host Defense. Cell Host & Microbe. 22 (3), 421-423 (2017).
- Corbett-Nelson, E. F., Mason, D., Marshall, J. G., Collette, Y., Grinstein, S. Signaling-dependent immobilization of acylated proteins in the inner monolayer of the plasma membrane. Journal of Cell Biology. 174 (2), 255-265 (2006).
- Yeung, T., et al. Receptor activation alters inner surface potential during phagocytosis. Science. 313 (5785), 347-351 (2006).
- Romano, P. S., Gutierrez, M. G., Beron, W., Rabinovitch, M., Colombo, M. I. The autophagic pathway is actively modulated by phase II Coxiella burnetii to efficiently replicate in the host cell. Cellular Microbiology. 9 (4), 891-909 (2007).
- Vieira, O. V., et al. Modulation of Rab5 and Rab7 recruitment to phagosomes by phosphatidylinositol 3-kinase. Molecular and Cellular Biology. 23 (7), 2501-2514 (2003).
- Roberts, R. L., Barbieri, M. A., Ullrich, J., Stahl, P. D. Dynamics of rab5 activation in endocytosis and phagocytosis. Journal of Leukocyte Biology. 68 (5), 627-632 (2000).
- Vitelli, R., et al. Role of the small GTPase Rab7 in the late endocytic pathway. Journal of Biological Chemistry. 272 (7), 4391-4397 (1997).
- Matte, C., et al. Leishmania major Promastigotes Evade LC3-Associated Phagocytosis through the Action of GP63. PLoS Pathogens. 12 (6), 1005690 (2016).
- Dias, B. R. S., et al. Autophagic Induction Greatly Enhances Leishmania major Intracellular Survival Compared to Leishmania amazonensis in CBA/j-Infected Macrophages. Frontiers in Microbiology. 9, 1890 (2018).
- Babcock, G. F. Quantitation of phagocytosis by confocal microscopy. Methods in Enzymology. 307, 319-328 (1999).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 071795 (2014).
- Lennartz, M. R. Phospholipases and phagocytosis: the role of phospholipid-derived second messengers in phagocytosis. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 31 (3-4), 415-430 (1999).
- Rashidfarrokhi, A., Richina, V., Tafesse, F. G. Visualizing the Early Stages of Phagocytosis. Journal of Visualized Experiments. (120), e54646 (2017).
- Ramarao, N., Meyer, T. F. Helicobacter pylori resists phagocytosis by macrophages: quantitative assessment by confocal microscopy and fluorescence-activated cell sorting. Infection and Immunity. 69 (4), 2604-2611 (2001).
- Bain, J., Gow, N. A., Erwig, L. P. Novel insights into host-fungal pathogen interactions derived from live-cell imaging. Seminars in Immunopathology. 37 (2), 131-139 (2015).
