Användning av organodling av Trowell-typ för att studera reglering av tandstamceller

Summary

Trowell-typ organodlingsmetod har använts för att avslöja komplexa signalnätverk som styr tandutveckling och, på senare tid, för att studera reglering involverad i stamceller i den kontinuerligt växande musens framtänd. Fluorescerande reporterdjurmodeller och levande avbildningsmetoder underlättar djupgående analyser av tandstamceller och deras specifika nischmikromiljö.

Abstract

Organutveckling, funktion och regenerering beror på stamceller, som finns i diskreta anatomiska utrymmen som kallas stamcellsnischer. Den kontinuerligt växande mussnittet ger en utmärkt modell för att studera vävnadsspecifika stamceller. De epitelvävnadsspecifika stamcellerna i snittet är belägna vid den proximala änden av tanden i en nisch som kallas livmoderhalsslingan. De ger en kontinuerlig tillströmning av celler för att motverka den konstanta nötningen av tandens självslipande spets. Här presenteras ett detaljerat protokoll för isolering och odling av den proximala änden av mussnittet som rymmer stamceller och deras nisch. Detta är ett modifierat organodlingsprotokoll av Trowell-typ som möjliggör in vitro-odling av vävnadsbitar (explanter), liksom de tjocka vävnadsskivorna vid vätske- / luftgränssnittet på ett filter som stöds av ett metallgaller. Organodlingsprotokollet som beskrivs här möjliggör vävnadsmanipulationer som inte är genomförbara in vivo , och i kombination med användning av fluorescerande rapportörer ger det en plattform för identifiering och spårning av diskreta cellpopulationer i levande vävnader över tid, inklusive stamceller. Olika regulatoriska molekyler och farmakologiska föreningar kan testas i detta system för deras effekt på stamceller och deras nischer. Detta ger i slutändan ett värdefullt verktyg för att studera stamcellsreglering och underhåll.

Introduction

Musframtänder växer kontinuerligt på grund av livslångt bevarande av stamcellerna (SC) som stöder den oupphörliga produktionen av tandkomponenter. Dessa inkluderar epitel-SC, som genererar emaljproducerande ameloblaster, och mesenkymala stamceller (MSC), som genererar dentinproducerande odontoblaster, bland andra celler¹. Epitel-SCs i de kontinuerligt växande framtänderna identifierades ursprungligen som etiketthållande celler^2,3 och har sedan dess visat sig uttrycka ett antal välkända stamhetsgener^, inklusive Sox2⁴. Dessa celler delar gemensamma drag med epitel-SC i andra organ och ligger inom SC-nischen som kallas livmoderhalsslingan som ligger på labialsidan av snittet. Nischen är en dynamisk enhet som består av celler och extracellulär matris som styr SC-aktivitet⁵. Lineage-tracing-studier har visat att Sox2+ epitel-SCs kan regenerera hela epitelfacket i tanden och att de är avgörande för successionell tandbildning ^6,7. MSC med dentinreparativ eller regenerativ potential rekryteras till stor del utanför organet genom blodkärl och nerver 8,9,10,11^, vilket ger en lämplig modell för att studera rekrytering, migration och boende av MSC-befolkningen.

Att studera SCs in vivo är inte alltid genomförbart, eftersom många av de genetiska och/eller farmakologiska manipulationerna kan påverka organhomeostas och/eller få dödliga konsekvenser. Därför ger organkultur ett utmärkt verktyg för att studera reglering av SCs och deras nischer in vitro. Orgelodlingssystemet som använder ett metallnät utvecklades ursprungligen av Trowell¹² för att studera organutveckling och har modifierats ytterligare av Saxen¹³ för att studera induktiva signaler vid njurutveckling. Sedan dess har denna in vitro-metod för odling av hela eller delar av organet framgångsrikt tillämpats inom olika områden. Inom tandutveckling har denna metod använts i stor utsträckning för att studera epitelial-mesenkymala interaktioner som styr tandutveckling¹⁴ och successionell tandbildning¹⁵. Thesleff-laboratoriets arbete har visat nyttan av detta system för tidsanalys av tandtillväxt och morfogenes, för analys av effekten av olika molekyler och tillväxtfaktorer på tandtillväxt och för time-lapse live imaging av tandutveckling^16,17. På senare tid har denna metod använts för att studera reglering av snitt-SCs och deras nisch^18,19, som beskrivs i detalj här.

Protocol

Detta protokoll omfattar användning av djur och alla förfaranden har godkänts av etiska kommittéer för användning och skötsel av djur och djuranläggningen vid Helsingfors universitet. 1. Beredning av orgelodlingsskålen Utför alla procedurer i en laminär flödeshuv. Rengör arbetsytor med 70% etanol och använd autoklaverade glasinstrument och lösningar. Sterilisera sax och annan metallutrustning i en glaspärlsterilisator. Förbered filter som normalt lagras i 7…

Representative Results

Epitel-SC: erna finns i en nisch som kallas livmoderhalsslingan, som ligger vid den proximala änden av snittet (figur 3A). Cervikala slingor är morfologiskt distinkta strukturer som består av inre och yttre emaljepitel som omsluter stellatretikulum, en kärna av löst arrangerade epitelceller (figur 3B, C). Det finns två livmoderhalsslingor i varje framtand (figur 3A), men endast den labiala livmoderhalsslingan …

Discussion

In vitro-organodling har använts i stor utsträckning för att studera induktiv potential och epitel-mesenkymala interaktioner som styr organtillväxt och morfogenes. Thesleff-laboratoriet har visat hur man kan anpassa Saxén-modifieringen av orgelkulturen av Trowell-typ och använda den för att studera tandutveckling¹⁴. De reproducerbara förhållandena och framstegen hos fluorescerande reportrar har gjort detta till en användbar metod för övervakning av tandmorfogenes och de distin…

Materials

1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors