장 상피는 영양 흡수뿐만 아니라 유해 물질에 대한 보호를 제공합니다. 정점-대부분의 상피 세포간 접합, 즉 타이트한 접합은 부세포 용질 및 이온 투과성을 조절한다. 여기에서, 점막 시트의 제조 및 어싱 챔버 기술을 사용하여 타이트한 접합부의 이온 선택성의 평가를 위한 프로토콜이 기재되어 있다.
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이 논문에서
요약
초록
Ussing 챔버 기술은 개구리 피부를 가로 지르는 나트륨의 세포 간 수송을 연구하기 위해 1951 년 덴마크 과학자 Hans Ussing에 의해 처음 발명되었습니다. 그 이후로,이 기술은 멤브레인을 가로 지르는 수송의 생리적 매개 변수를 연구하기 위해 많은 다른 조직에 적용되었습니다. Ussing chamber 방법은 네이티브 조직을 사용할 수 있기 때문에 다른 방법보다 바람직하므로 생체 내에서 일어나는 일에보다 적용 할 수 있습니다. 그러나 네이티브 조직이 사용되기 때문에 처리량이 낮고 시간이 제한되며 조직 준비에는 기술과 훈련이 필요합니다. 이 챔버는 다양한 조직에서 특정 수송체 단백질을 연구하고, 낭포성 섬유증과 같은 질병 병리 생리학을 이해하고, 약물 수송 및 섭취를 연구하고, 특히 장내 영양 수송에 대한 이해에 기여했습니다. 조직의 전체 상피 수송 과정을 감안할 때, 경상피 경로뿐만 아니라 부세포 경로도 중요합니다. 단단한 접합부는 장 전체에 걸친 조직 특이적 부세포 투과성의 핵심 결정 요인입니다. 이 기사에서, Ussing 챔버 기술은 경상피 전도도 및 희석 전위를 측정하여 이온의 부세포 투과성을 평가하는 데 사용됩니다.
서론
Ussing 챔버 방법은 덴마크 과학자 Hans Ussing에 의해 처음 개발되었습니다. Ussing은 NaCl이 가파른 농도 구배에 대해 피부를 가로 질러 수송 될 수 있다는 것을 관찰 한 후 개구리 피부를 가로 질러 나트륨 수송의 단락 전류를 측정하기 위해 처음 사용했습니다1. 그의 시스템은 피부의 양쪽에 접근 할 수있는 두 개의 챔버 사이에 장착 된 개구리 피부로 구성되었습니다. 각 챔버에는 순환되고 폭기된 링거의 용액이 들어 있었다. 피부 근처에 위치하여 포화 KCl-calomel 전극에 연결된 두 개의 좁은 한천 링거 브릿지는 포텐셔너에 의해 판독된 전위차를 측정하였다. 두 번째 한 쌍의 한천 링거 브리지는 배터리에 의해 제공되는 기전력을 인가하기 위해 AgCl로 포화된 KCl을 갖는 비커에 연결된 각 챔버의 반대쪽 끝에 위치하였다. 전위 분배기를 사용하여 전압을 조정하여 피부 전체의 전위차가 제로로 유지되어 단락 조건을 만들었습니다. 마이크로암페어 미터는 또한 피부를 통과하는 전류를 판독하기 위해 연결되었다(원래의 챔버 설계에 대해서는 ref.1 의 그림 참조).
지난 70 년 동안이 기술은 영양소와 이온 수송을 연구하기 위해 많은 다른 조직, 특....
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프로토콜
이 실험에 사용된 모든 동물은 시즈오카 대학의 동물 보호 시설에서 유지되었으며, 실험은 시즈오카 대학이 정한 동물 연구 지침에 따라 수행되었다. 모든 실험은 시즈오카 대학의 동물 관리 및 사용위원회 (허가 #205272 및 #656-2303)의 승인을 받아 수행되었습니다.
1. NaCl 전극의 제조
참고: 이 실험에 사용된 전극은 농축된 NaCl 또는 KCl로 구성된다. KCl/calomel 전극은 상업적으로 구입합니다. 실험을 시작하기 전에 모든 전극이 농축된 NaCl 또는 KCl 용액으로 상부에 채워져 있는지 확인하십시오.
- 플라스틱 뚜껑이 달린 작은 유리 병을 준비하십시오 (부피 20 mL).
- 플라스틱 뚜껑에 두 개의 구멍을 뚫고, 하나는 NaCl 소금 다리 (직경 2.5mm)이고 다른 하나는 은선 (직경 1mm; 도 1C, NaCl 전극).
- 유리 병을 포화 NaCl 용액으로 채 웁니다 (약 15 mL, 가득 찰 때까지).
- 항아리에 은선(직경 0.8mm, 길이 7cm)을 넣하되 항아리 외부의 와이어 부분을 악어 클립(작은 크기)을 통해 앰프 시스템에 연결할 수 있는지....
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결과
이 백서에 표시된 결과는 완료된 더 큰 프로젝트의 일부인 결과입니다(ref.4,23,24 참조).
소장의 경상피 전기 전도도는 Cldn15-/- 마우스에서 감소된다.
Cldn15-/- 마우스에서 중간 소장 세그먼트의 기준선 경점막 전도도(단락 조건 하에서)는 야생형 마우스에서 측정된 것보다 낮았다(도 3A; Cldn15-/- 및 야생형 마우스에서 각각 22.3 mS/cm2 및 48.7 mS/cm2
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토론
이 실험에서, Ussing 챔버는 Cldn15-/- 및 WT 마우스의 소장에서 NaCl의 기준선 전기 파라미터 및 희석 전위를 측정하기 위해 사용되었다. Ussing 챔버 실험을 수행 할 때 실험에 사용 된 멤브레인 준비가 실행 가능한지 확인하는 것이 매우 중요합니다. 이것은 일반적으로 포도당 또는 아데닐레이트 사이클라제 활성화제 포스콜린을 첨가하고 Isc (마우스에서 100-300 μA / cm2)에 적절한 상승이 있는지 여부를 확인함으로써 수행됩니다. 장 제제가 사용하기에 허용되는지 여부를 평가하는 또 다른 방법은 조직의 전도도를 보는 것입니다. 손상된 조직은 종종 정상 전도도(정상 전도도: 마우스의 경우 ~20-60 mS/cm2)보다 높은 반면, 근육층이 적절하게 벗겨지지 않은 조직은 정상보다 낮은 전도도를 갖는 경향이 있습니다(그림 2). 모든 Ussing 챔.......
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공개 사항
저자는 공개 할 잠재적 인 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 17K00860(HH로) 및 19K20152(NI로)에서 지원됩니다. WH는 오츠카 도시미 장학금 재단이 2018-2021 년의 재정 지원을 인정하고자합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| # 3 폴리 에틸 튜빙 | Hibiki | 외경 1.0 mm; 내경 0.5 mm | |
| #7 폴리 에틸 튜빙 | Hibiki | 외경 2.3 mm; 내경 1.3 mm | |
| 10 mL 잠금 주사기 | Terumo | SS-10LZ | |
| 19g 바늘 | Terumo | NN-1938R | 바늘로 작업할 때 주의하고 날카로운 물건 용기에 버리십시오 |
| 23g 바늘 | Terumo | NN-2332R | 바늘로 작업할 때 주의하고 날카로운 물건 용기에 버리십시오 |
| 5mm 펀치 | NA | NA 여과지와 파라필름 침에 구멍을 뚫는 데 사용하십시오 | |
| Seirin | NS | 해부 플레이트에 조직을 고정하는 해부 핀으로 사용됩니다. | |
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| CaCl2 | Fujifilm Wako | 038-00445 | |
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| 인도메타신 | 시그마 | I7338-5G | 21 mM NaHCO3에 1 mM 스톡을 만들고 최종 농도는 10 µ입니다. M |
| K2HPO4 | Fujifilm Wako | 164-04295 | |
| KCl | Fujifilm Wako | 163-03545 | |
| KCl/calomel 전극 | Asch Japan Co. | SCE-100 | |
| KH2PO<>4 | Kanto 화학 | 32379-00 | |
| L(+)-글루타민 | 후지필름 Wako | 074-00522 | |
| MgCl2 | Fujifilm Wako | 135-00165 | |
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참고문헌
- Ussing, H. H., Zerahn, K. Active transport of sodium as the source of electric current in the short-circuited isolated frog skin. Acta Physiologica Scandinavica. 23, 110-127 (1951).
- Field, M.
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재인쇄 및 허가
