주사기와 바늘을 사용하여 순환 종양 세포에 혈역학 적 스트레스의 효과 모델링
Summary
여기서 우리는 순환 종양 세포에 대한 혈역학 적 스트레스의 효과를 모델링하기 위해 현탁액의 암세포에 유체 전단 스트레스를 적용하는 방법을 시연한다.
Abstract
전이 도중, epithelia를 포함하여 고체 조직에서 암세포는, 혈역학 적인 흐름 때문에 기계적인 긴장에 드러나는 림프및 조혈 순환에 접근을 얻습니다. 순환 종양 세포 (CtC) 경험 이러한 스트레스 중 하나는 유체 전단 스트레스 (FSS)입니다. 암세포는 간질 적인 흐름 때문에 종양 내의 FSS의 낮은 수준을 경험할 수 있는 동안, CTC는, 세포외 매트릭스 부착 없이, FSS의 훨씬 더 중대한 수준에, 드러냅니다. 생리학적으로, 금감원은 3~4배 이상의 크기로 림프제(<1dyne/cm2)에 존재하는 낮은수준과 세포가 심장을 통과하고 심장 판막(>500dynes/cm2)을통과할 때 가장 높은 수준이 간략하게 존재한다. 다양한 시간 프레임에 걸쳐 다양한 범위의 생리 전단 응력을 모델링하도록 설계된 몇 가지 체외 모델이 있습니다. 이 논문은 간단한 주사기 및 바늘 시스템을 사용하여 암 세포 생물학에 대한 높은 수준의 FSS의 짧은 (밀리초) 펄스의 결과를 조사하는 모델을 설명합니다.
Introduction
전이, 또는 초기 종양 부위를 넘어 암의 확산은 암 사망률1의근본적인 주요 인자이다. 전이 중, 암세포는 순환 계통을 고속도로로서 활용하여 몸 전체에 먼 부위로 전파한다2,3. 이러한 사이트로 가는 도중에, 순환 종양 세포(CtC)는 그들의 원래 1차종양3,4,5와는 달리 동적 유체 미세 환경 내에 존재한다. 이 유체 미세 환경은 전이4에많은 장벽 중 하나입니다 제안되었습니다. 전이성 비효율성의 개념, 즉, 순환을 입력하는 대부분의 CtC가 멸망하거나 생산적인 전이성 콜로니6,7,8을형성하지 않는다는개념에대한 광범위한 합의가 있다. 그러나, 왜 전이개별 CTC의 관점에서 비효율적이다는 것은 덜 확실하고 조사의 적극적인 영역으로 남아 있습니다. CTC는 세포외 매트릭스로부터 분리되고, 1차 종양에 존재할 수 있는 수용성 성장 및 생존 인자를 박탈하고, 1차 종양4와는 훨씬 다른 방식으로 면역 계통 및 혈역학력에 노출된다. 이러한 요인의 각각은 CtC의 가난한 생존에 기여할 수 있습니다,하지만 그들의 상대적 기여는 불분명하다. 이 백서는 혈역학적 힘이 CTC에 미치는 영향에 대한 문제를 다룹니다.
CTC에 대한 혈역학적 힘의 영향을 연구하는 것은 매우 어렵습니다. 현재, 전체 현부종 역학 (모세 혈관에 심장) 및 인간 혈관 시스템의 유변학적 특성을 복제 할 수있는 체외 시스템에 엔지니어링 된 이 없습니다. 또한 CtC가 순환 시스템을 어떻게 경험하는지 완전히 명확하지는 않습니다. 실험적인 기록은 대부분의 암세포가 혈액 세포 같이 연속해서 순환하지 않는다는 것을 표시합니다. 오히려, 비교적 큰 크기(직경 10-20 μm)로 인해 대부분의 CTC는 모세관 침대(직경 6-8 μm)에 갇혀 가변 길이(들에서 일)에 대해 죽거나 사치스라우거나 다음 모세혈관 침대8,9,10,11로변위된다. 그러나 CTC 크기가 생체 내에서 더 이질적일 수 있으며 더 작은 CTC가12를검출할 수 있다는 몇 가지 증거가 있습니다. 따라서 거리 및 혈류 속도에 따라 CTC는 이러한 함정 기간 사이에 몇 초 동안만 자유롭게 순환할 수 있지만 이러한 행동에 대한 정량적 설명은13이부족합니다.
또한, CtC가 혈액 순환을 입력하는 위치에 따라, 그들은 폐 및 기타 주변 부위의 여러 모세관 침대를 통과하고 최종 목적지에 도달하기 전에 오른쪽과 왼쪽 심장을 통과 할 수 있습니다. 길을 따라, CTC는 유체 전단 응력 (FSS), 마이크로 순환에 자신의 함정 동안 압축 력, 잠재적으로, 그들은 혈관 벽을 따라 백혈구와 같은 롤링을 나타낼 수있는 상황에서 견인 력을 포함하여 다양한 혈역학 적 스트레스에노출된다 14. 따라서, 모델링할 CTC 동작의 순환 및 이해를 모델링하는 능력은 모두 제한적이다. 이 불확실성 때문에, 체외 모형 시스템에서 어떤 사실 인정든지 실험적인 척추동물 유기체에서 그리고 궁극적으로, 암 환자에서 확인되어야 합니다.
앞서 언급한 주의 사항으로, 이 논문은 2012년15년에처음 설명된 CTC에 대한 FSS의 효과를 조사하기 위해 현탁액의 세포에 FSS를 적용하는 비교적 간단한 모델을 보여 준다. 금감원은 혈관 벽에 대한 혈류의 마찰로 인해 더 큰 혈관의 라미나르 흐름 조건에서 포물선 속도 그라데이션을 생성합니다. 세포는 혈관 벽 근처 FSS의 상부를 경험하고 혈관의 중심 근처 낮은 수준. 하겐-포수유 방정식에 의해 설명된 바와 같이, 흐름이 발생하는 도관의 유체 점도, 유량 및 치수는 FSS에 영향을 미친다. 이것은 뉴턴 액체로 행동하는 혈액 흐름에 적용되지만 미세 순환을 위해 보유하지 않습니다. 생리적 금감원은 림프계(<1dyn/cm2)에서가장 낮은 수준과 심장 판막 및 죽상 경화성 플라크(>500 dyn/cm2)5에서가장 높은 수준으로 여러 수주 이상의 크기를 다양하게 다양하게 다수 범위로 한다. 동맥의 평균 벽 전단 응력은 10-70 dyn/cm2 및 1-6 dyn/cm2 in 정맥16,17이다.
심장에서, 세포는 매우 높은 수준의 밸브 전단지 주위의 난류 흐름에 노출될 수 있지만, 매우 짧은 기간 FSS는18,19를경험할 수 있다. 바이오프로시전은 오랫동안 FSS가 현탁액의 포유류 세포에 미치는 영향을 연구해 왔지만, 이 정보는 일반적으로장기간 20에걸쳐 적용되는 FSS의 훨씬 낮은 수준에 초점을 맞추고 있기 때문에 CtC에 대한 FSS의 효과를 이해하기 위한 제한된 가치일 수 있다. 아래에 설명된 바와 같이, 주사기와 바늘을 사용하여, 세포 현탁액에 상대적으로 짧은 (밀리초) 기간 동안 상대적으로 높은 (수만 ~ 수천 개의 다인/cm2)FSS를 적용할 수 있다. 이모델(15)의초기 설명 이후, 다른 사람들은암세포(21,22,23)에대한 FSS의 효과를 연구하기 위해 이를채택하였다. FSS의 여러 “펄스”는 다운스트림 실험 분석을 용이하게하기 위해 짧은 기간 동안 세포 현탁액에 적용 될 수 있습니다. 예를 들어, 이 모델은 적용된 펄스 수의 함수로서 세포 생존가능성을 측정하여 FSS에 의한 기계적 파괴에 저항하는 세포의 능력을 측정하는 데 사용될 수 있다. 대안적으로, FSS 노출이 암세포의 생물학에 미치는 영향은 다양한 다운스트림 분석을 위해 세포를 수집하여 탐구할 수 있다. 중요한 것은, 셀 서스펜션의 일부는 정지에 보관된 세포 분리 및 시간과 연관될 수 있는 것과 FSS의 효력을 비교하기 위하여 정적 제어로 예약됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 주사기와 바늘을 사용하여 현탁액의 암세포에 FSS의 적용을 보여줍니다. 이 모델을 사용하여, 암세포는 비변형 상피세포(15,22,24)에비해 높은 수준의 FSS의 짧은 펄스에 더 저항하는 것으로 나타났다. 더욱이, 본 모델을 이용한 금감원에 노출되면 세포 강성, RhoA의 활성화, 피질 F-액틴 및 미오신 II 기반 수축도<sup class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
여기에서 입증된 모델의 개발은 DOD 보조금 W81XWH-12-1-0163, NIH 보조금 R21 CA179981 및 R21 CA196202 및 사토 메타스타시스 연구 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL round bottom tubes | Falcon – Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 96-well black bottom plate | Costar – Corning | 3915 | |
| Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
| BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| crystal violet | Sigma | C0775 | |
| D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Strilic, B., Offermanns, S. Intravascular survival and extravasation of tumor cells. Cancer Cell. 32 (3), 282-293 (2017).
- Labelle, M., Hynes, R. O. The initial hours of metastasis: the importance of cooperative host-tumor cell interactions during hematogenous dissemination. Cancer Discovery. 2 (12), 1091-1099 (2012).
- Krog, B. L., Henry, M. D. Biomechanics of the circulating tumor cell microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1092, 209-233 (2018).
- Weiss, L. Metastatic inefficiency. Advances in Cancer Research. 54, 159-211 (1990).
- Zeidman, I., Mc, C. M., Coman, D. R. Factors affecting the number of tumor metastases; experiments with a transplantable mouse tumor. 암 연구학. 10 (6), 357-359 (1950).
- Fidler, I. J. Metastasis: quantitative analysis of distribution and fate of tumor embolilabeled with 125 I-5-iodo-2′-deoxyuridine. Journal of the National Cancer Institute. 45 (4), 773-782 (1970).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. 암 연구학. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. American Journal of Pathology. 153 (3), 865-873 (1998).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16 (1), 116-122 (2010).
- Takagi, H., et al. Analysis of the circulating tumor cell capture ability of a slit filter-based method in comparison to a selection-free method in multiple cancer types. International journal of molecular sciences. 21 (23), 9031 (2020).
- Scott, J., Kuhn, P., Anderson, A. R. Unifying metastasis–integrating intravasation, circulation and end-organ colonization. Nature Reviews Cancer. 12 (7), 445-446 (2012).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Barnes, J. M., Nauseef, J. T., Henry, M. D. Resistance to fluid shear stress is a conserved biophysical property of malignant cells. PLoS One. 7 (12), 50973 (2012).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Brass, L. F., Diamond, S. L. Transport physics and biorheology in the setting of hemostasis and thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 906-917 (2016).
- Stein, P. D., Sabbah, H. N. Turbulent blood flow in the ascending aorta of humans with normal and diseased aortic valves. Circulation Research. 39 (1), 58-65 (1976).
- Strony, J., Beaudoin, A., Brands, D., Adelman, B. Analysis of shear stress and hemodynamic factors in a model of coronary artery stenosis and thrombosis. The American Journal of Physiology. 265 (5), 1787-1796 (1993).
- Chalmers, J. J. Mixing, aeration and cell damage, 30+ years later: what we learned, how it affected the cell culture industry and what we would like to know more about. Current Opinion in Chemical Engineering. 10, 94-102 (2015).
- Vennin, C., et al. Trsient tissue priming via ROCK inhibition uncouples pancreatic cancer progression, sensitivity to chemotherapy, and metastasis. Science Translational Medicine. 9 (384), 126 (2017).
- Mitchell, M. J., et al. Lamin A/C deficiency reduces circulating tumor cell resistance to fluid shear stress. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 309 (11), 736-746 (2015).
- Ortiz-Otero, N., et al. Cancer associated fibroblasts confer shear resistance to circulating tumor cells during prostate cancer metastatic progression. Oncotarget. 11 (12), 1037-1050 (2020).
- Moose, D. L., et al. Cancer cells resist mechanical destruction in circulation via RhoA/actomyosin-dependent mechano-adaptation. Cell Reports. 30 (11), 3864-3874 (2020).
- Miller, B. E., Miller, F. R., Wilburn, D. J., Heppner, G. H. Analysis of tumour cell composition in tumours composed of paired mixtures of mammary tumour cell lines. British Journal of Cancer. 56 (5), 561-569 (1987).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. 암 연구학. 52 (6), 1399 (1992).
- Chivukula, V. K., Krog, B. L., Nauseef, J. T., Henry, M. D., Vigmostad, S. C. Alterations in cancer cell mechanical properties after fluid shear stress exposure: a micropipette aspiration study. Cell Health Cytoskeleton. 7, 25-35 (2015).
- Gensbittel, V., et al. Mechanical adaptability of tumor cells in metastasis. Developmental Cell. 56 (2), 164-179 (2021).
- O’Leary, B. R., et al. Pharmacological ascorbate inhibits pancreatic cancer metastases via a peroxide-mediated mechanism. Scientific Reports. 10 (1), 17649 (2020).
- Williams, A. R., Hughes, D. E., Nyborg, W. L. Hemolysis near a transversely oscillating wire. Science. 169 (3948), 871-873 (1970).
- Rooney, J. A. Hemolysis near an ultrasonically pulsating gas bubble. Science. 169 (3948), 869-871 (1970).
- Connolly, S., McGourty, K., Newport, D. The in vitro inertial positions and viability of cells in suspension under different in vivo flow conditions. Scientific Reports. 10 (1), 1711 (2020).
- Brooks, D. E. The biorheology of tumor cells. Biorheology. 21 (1-2), 85-91 (1984).
- Triantafillu, U. L., Park, S., Klaassen, N. L., Raddatz, A. D., Kim, Y. Fluid shear stress induces cancer stem cell-like phenotype in MCF7 breast cancer cell line without inducing epithelial to mesenchymal transition. Internation Journal of Oncology. 50 (3), 993-1001 (2017).
- Fan, R., et al. Circulatory shear flow alters the viability and proliferation of circulating colon cancer cells. Scientific Reports. 6, 27073 (2016).
- Fu, A., et al. High expression of MnSOD promotes survival of circulating breast cancer cells and increases their resistance to doxorubicin. Oncotarget. 7 (31), 50239-50257 (2016).
- Li, S., et al. Shear stress promotes anoikis resistance of cancer cells via caveolin-1-dependent extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Journal of Cellular Physiology. 234 (4), 3730-3743 (2019).
- Xin, Y., et al. Mechanics and actomyosin-dependent survival/chemoresistance of suspended tumor cells in shear flow. Biophysical Journal. 116 (10), 1803-1814 (2019).
