Modellierung der Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen mit Spritze und Nadel
Summary
Hier demonstrieren wir eine Methode, um flüssigen Scherstress auf Krebszellen in Suspension anzuwenden, um die Auswirkungen von hämodynamischem Stress auf zirkulierende Tumorzellen zu modellieren.
Abstract
Während der Metastasierung erhalten Krebszellen aus festem Gewebe, einschließlich Epithelien, Zugang zum lymphatischen und hämatogenen Kreislauf, wo sie aufgrund des hämodynamischen Flusses mechanischem Stress ausgesetzt sind. Eine dieser Belastungen, die zirkulierende Tumorzellen (CTCs) erfahren, ist der Flüssigkeitsscherstress (FSS). Während Krebszellen aufgrund des interstitiellen Flusses niedrige FSS-Spiegel im Tumor erfahren können, sind CTCs ohne extrazelluläre Matrixbindung viel höheren FSS-Spiegeln ausgesetzt. Physiologisch liegt FSS über 3-4 Größenordnungen, wobei niedrige Konzentrationen in Lymphgefäßen vorhanden sind (<1 Dyne / cm2) und die höchsten Werte kurz vorhanden sind, wenn Zellen durch das Herz und um Herzklappen gehen (>500 Dynen / cm2). Es gibt einige In-vitro-Modelle, die entwickelt wurden, um verschiedene Bereiche physiologischer Scherspannung über verschiedene Zeiträume zu modellieren. Dieser Artikel beschreibt ein Modell zur Untersuchung der Folgen von kurzen (Millisekunden-) Pulsen von High-Level-FSS auf die Krebszellbiologie mit einem einfachen Spritzen- und Nadelsystem.
Introduction
Metastasierung oder die Ausbreitung von Krebs über die ursprüngliche Tumorstelle hinaus ist ein Hauptfaktor, der der Krebsmortalitätzugrunde 1. Während der Metastasierung nutzen Krebszellen das Kreislaufsystem als Autobahn, um sich an entfernte Stellen im ganzen Körper zu verbreiten2,3. Auf dem Weg zu diesen Stellen existieren zirkulierende Tumorzellen (CTCs) in einer dynamischen flüssigen Mikroumgebung, die sich von der ihres ursprünglichen Primärtumors3,4,5 entiert. Es wurde vorgeschlagen, dass diese flüssige Mikroumgebung eine von vielen Barrieren für Metastasierungen ist4. Es besteht weitgehende Übereinstimmung im Konzept der metastatischen Ineffizienz, d.h. dass die meisten CTCs, die in den Kreislauf gelangen, entweder zugrunde gehen oder keine produktiven metastatischen Kolonien bilden6,7,8. Warum Metastasen aus Sicht eines einzelnen CTC ineffizient sind, ist jedoch weniger sicher und bleibt ein aktives Untersuchungsgebiet. CTCs werden von der extrazellulären Matrix losgelöst, von löslichen Wachstums- und Überlebensfaktoren beraubt, die im Primärtumor vorhanden sein können, und dem Immunsystem und den hämodynamischen Kräften auf eine ganz andere Weise ausgesetzt als im Primärtumor4. Jeder dieser Faktoren kann zum schlechten Überleben von CTCs beitragen, aber ihre relativen Beiträge sind unklar. Dieser Beitrag befasst sich mit der Frage, wie hämodynamische Kräfte CTCs beeinflussen.
Die Untersuchung der Auswirkungen hämodynamischer Kräfte auf CTCs ist eine ziemliche Herausforderung. Derzeit gibt es keine entwickelten In-vitro-Systeme, die die gesamte raumzeitliche Dynamik (Herz zu Kapillaren) und rheologischen Eigenschaften des menschlichen Gefäßsystems replizieren können. Darüber hinaus ist nicht ganz klar, wie CTCs das Kreislaufsystem erleben. Experimentelle Beweise deuten darauf hin, dass die meisten Krebszellen nicht kontinuierlich wie Blutzellen zirkulieren. Vielmehr werden die meisten CTCs aufgrund ihrer relativ großen Größe (10-20 μm Durchmesser) für variable Zeiträume (s bis Tage) in Kapillarbetten (6-8 μm Durchmesser) gefangen, wo sie sterben, extravasieren oder in das nächste Kapillarbett 8,9,10,11verschoben werden können . Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass die CTC-Größe in vivo heterogener sein kann und dass kleinere CTCs nachweisbar sind12. Daher können CTCs basierend auf Entfernung und Blutflussgeschwindigkeit nur für eine Frage von Sekunden zwischen diesen Einklemmungsperioden frei zirkulieren, obwohl eine quantitative Beschreibung dieses Verhaltens fehlt13.
Darüber hinaus können CTCs je nachdem, wo SIE in den Kreislauf gelangen, mehrere Kapillarbetten in der Lunge und anderen peripheren Stellen sowie durch das rechte und linke Herz passieren, bevor sie ihr endgültiges Ziel erreichen. Auf dem Weg sind CTCs verschiedenen hämodynamischen Belastungen ausgesetzt, einschließlich Flüssigkeitsscherspannung (FSS), Druckkräften während ihres Einklemmens in der Mikrozirkulation und möglicherweise Zugkräften unter Umständen, unter denen sie leukozytenartiges Rollen entlang der Blutgefäßwände aufweisen könnten14. Somit ist sowohl die Fähigkeit, die Zirkulation zu modellieren, als auch das Verständnis des zu modellierenden CTC-Verhaltens begrenzt. Aufgrund dieser Unsicherheit sollten alle Erkenntnisse aus In-vitro-Modellsystemen in einem experimentellen Wirbeltierorganismus und letztendlich bei Krebspatienten validiert werden.
Mit den oben genannten Vorbehalten zeigt dieses Papier ein relativ einfaches Modell, um FSS auf Zellen in Suspension anzuwenden, um die Auswirkungen von FSS auf CTCs zu untersuchen, die erstmals 2012 beschriebenwurden 15. FSS resultiert aus der Reibung des Blutflusses gegen die Gefäßwand, die unter Bedingungen der laminaren Strömung in größeren Gefäßen einen parabolischen Geschwindigkeitsgradienten erzeugt. Zellen erfahren höhere FSS-Spiegel in der Nähe von Gefäßwänden und niedrigere Werte in der Nähe der Mitte des Blutgefäßes. Flüssigkeitsviskosität, Durchflussrate und Abmessungen der Leitung, durch die die Strömung erfolgt, beeinflussen FSS, wie in der Hagen-Poiseuille-Gleichung beschrieben. Dies gilt für Blutströme, die sich wie Newtonsche Flüssigkeiten verhalten, gilt jedoch nicht für die Mikrozirkulation. Physiologische FSS erstreckt sich über mehrere Größenordnungen mit den niedrigsten Werten in der Lymphe (<1 dyn/cm2) und den höchsten in Regionen um Herzklappen und atherosklerotische Plaques (>500 dyn/cm2)5. Die mittlere Wandscherspannung in den Arterien beträgt 10-70 dyn/cm2 und 1-6 dyn/cm2 in den Venen16,17.
Im Herzen können Zellen turbulenten Strömungen um Klappenblättchen ausgesetzt sein, wo sehr hohe, aber sehr kurze Dauer FSS auftreten kann18,19. Obwohl das Bioprozessfeld seit langem die Auswirkungen von FSS auf Säugetierzellen in Suspension untersucht, können diese Informationen für das Verständnis der Auswirkungen von FSS auf CTCs von begrenztem Wert sein, da sie sich im Allgemeinen auf viel niedrigere FSS-Spiegel konzentrieren, die über eine lange Dauer angewendet werden20. Wie unten beschrieben, kann man mit einer Spritze und einer Nadel relativ hohe (zehn bis tausend dyn/cm2)FSS für eine relativ kurze (Millisekunden) Dauer auf eine Zellsuspension auftragen. Seit der ersten Beschreibung dieses Modells15haben andere es verwendet, um die Auswirkungen von FSS auf Krebszellen21,22,23zu untersuchen. Mehrere “Impulse” von FSS können in kurzer Zeit auf Zellsuspensionen angewendet werden, um nachgelagerte experimentelle Analysen zu erleichtern. Zum Beispiel kann dieses Modell verwendet werden, um die Fähigkeit von Zellen zu messen, mechanischer Zerstörung durch FSS zu widerstehen, indem die Zelllebensfähigkeit in Abhängigkeit von der Anzahl der angewendeten Impulse gemessen wird. Alternativ können die Auswirkungen der FSS-Exposition auf die Biologie von Krebszellen untersucht werden, indem Zellen für eine Vielzahl von nachgelagerten Analysen gesammelt werden. Wichtig ist, dass ein Teil der Zellsuspension als statische Kontrolle reserviert ist, um die Auswirkungen von FSS mit denen zu vergleichen, die mit Zellablösung und Zeit in Suspension verbunden sein könnten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Papier demonstriert die Anwendung von FSS auf Krebszellen in Suspension mit einer Spritze und einer Nadel. Mit diesem Modell wurde gezeigt, dass Krebszellen resistenter gegen kurze Pulse von High-Level-FSS im Vergleich zu nicht transformierten Epithelzellensind 15,22,24. Darüber hinaus führt die Exposition gegenüber FSS unter Verwendung dieses Modells zu einem schnellen Anstieg der Zellsteifigkeit, Aktivierung von RhoA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Entwicklung des hier gezeigten Modells wurde durch den DOD-Zuschuss W81XWH-12-1-0163, den NIH-Zuschüssen R21 CA179981 und R21 CA196202 sowie den Sato Metastasis Research Fund unterstützt.
Materials
| 0.25% Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| 14 mL round bottom tubes | Falcon – Corning | 352059 | |
| 30 G 1/2" Needle | BD | 305106 | |
| 5 mL syringe | BD | 309646 | |
| 96-well black bottom plate | Costar – Corning | 3915 | |
| Bioluminescence detector | AMI | AMI HTX | |
| BSA, Fraction V | Sigma | 10735086001 | |
| Cell Titer Blue | Promega | G8081 | |
| crystal violet | Sigma | C0775 | |
| D-luciferin | GoldBio | D-LUCK | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| PBS | Gibco | 10010023 | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HT | |
| Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S2002 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-3005 |
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