Обнаружение нейтрализующих антител SARS-CoV-2 с использованием высокопроизводительной флуоресцентной визуализации псевдовирусной инфекции
Summary
Протокол, описанный здесь, описывает быстрый и эффективный метод измерения нейтрализующих антител против спайкового белка SARS-CoV-2 путем оценки способности реконвалесцентных образцов сыворотки ингибировать инфекцию усиленным зеленым флуоресцентным белком меченым вирусом везикулярного стоматита, псевдотипизированным с шиповым гликопротеином.
Abstract
Поскольку пандемия COVID-19, вызванная тяжелым острым респираторным синдромом коронавируса 2 (SARS-CoV-2), продолжает развиваться, стало очевидно, что наличие нейтрализующих антител против вируса может обеспечить защиту от будущей инфекции. Таким образом, поскольку создание и трансляция эффективных вакцин против COVID-19 продолжается с беспрецедентной скоростью, разработка быстрых и эффективных методов измерения нейтрализующих антител против SARS-CoV-2 будет становиться все более важной для определения долгосрочной защиты от инфекции как для ранее инфицированных, так и для иммунизированных лиц. В этой статье описывается высокопроизводительный протокол с использованием вируса везикулярного стоматита (VSV), псевдотипизированного с шиповым белком SARS-CoV-2, для измерения наличия нейтрализующих антител в реконвалесцентной сыворотке у пациентов, которые недавно выздоровели от COVID-19. Использование реплицируемого псевдотипного вируса устраняет необходимость в объекте сдерживания уровня 3, необходимом для обработки SARS-CoV-2, что делает этот протокол доступным практически для любой лаборатории уровня сдерживания 2. Использование формата 96 скважин позволяет одновременно запускать множество образцов с коротким временем обработки 24 ч.
Introduction
В декабре 2019 года был выявлен новый коронавирус, который мы теперь знаем как SARS-CoV-2, возбудитель коронавирусной болезни 2019 (COVID-19)1. SARS-CoV-2 — бетакоронавирус, принадлежащий к семейству Coronaviridae. Эти вирусы в оболочке содержат большой геном РНК с положительным смыслом и ответственны за респираторные и кишечные инфекции как у людей, так и уживотных2. По состоянию на май 2021 года во всем мире зарегистрировано более 157 миллионов случаев COVID-19 и более 3,2 миллиона смертей3. Разработка эффективной вакцины стала основной целью исследователей по всему миру, по крайней мере, 77 доклинических вакцин находятся в стадии исследования и 90 в настоящее время проходят клинические испытания4.
Коронавирусы кодируют четыре структурных белка, включая спайк-белок (S), нуклеокапсид (N), белок оболочки (E) и мембранный белок (M). Вступление SARS-CoV-2 требует взаимодействия рецептор-связывающего домена (RBD) S с рецептором хозяина, человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (hACE2) и последующим слиянием мембран после протеолитического расщепления клеточной сериновой протеазой хозяина, трансмембранной протеазой серином 2 (TMPRSS2)5,6,7,8,9,10 . Гуморальная иммунодоминальность S-белка SARS-CoV была ранее сообщена и теперь показана также для SARS-CoV-211,12,13. Действительно, нейтрализующие реакции антител против S были обнаружены у выздоравливающих сывороток пациентов с SARS-CoV через 24 месяца после заражения14,что подчеркивает их критическую роль в долгосрочном иммунном ответе. Белок S был идентифицирован как перспективная мишень для вакцин и, таким образом, стал ключевым компонентом большинства разрабатываемых вакцин15,16.
Хотя быстрое выявление нейтрализующих антител является критическим аспектом разработки вакцины, оно может также пролить свет на уровень инфицирования и сероэпидемиологический надзор в затронутых районах17. Компетентный к репликации VSV псевдотипизированный с гликопротеином SARS-CoV-2 S вместо гликопротеина VSV дикого типа для изучения инфекции SARS-CoV-2 в условиях биобезопасности уровня 2 был любезно пожертвован Уиланом и его коллегами18. VSV-экспрессирующий спайк (VSV-S) будет использоваться для определения нейтрализующего ответа антител против спайкового белка SARS-CoV-2. Поскольку VSV-S, используемый здесь, также экспрессирует усиленный зеленый флуоресцентный белок (eGFP), очаги eGFP могут быть обнаружены в течение 24 ч для количественной оценки инфекции, тогда как образование бляшек может занять от 48 до 72 ч. Здесь обобщен простой и эффективный протокол определения способности выздоравливающей сыворотки пациента нейтрализовать инфекцию VSV-S-eGFP. Этот метод также может быть легко адаптирован для опроса других потенциальных терапевтических средств, которые направлены на нарушение взаимодействия хозяина с вирусом белка SARS-CoV-2 S.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь, может быть адаптирован к различным лабораторным средам и ресурсам по мере необходимости. Важно отметить, что основным ограничением этого протокола является необходимость защиты пространства уровня 2 и вытяжки культуры тканей. Применение реплицируемого РНК-вир?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить лабораторию Уилана за щедрое предоставление вируса VSV-S-eGFP, используемого в этом протоколе (описанного в Case et al. 2020). Мы также благодарим докторов Билла Кэмерона и Ютапорна Коуэна (и команду) за сбор образцов крови пациента (идентификатор протокола REB 20200371-01H). Авторы раскрывают получение следующей финансовой поддержки для исследования, авторства и / или публикации этой статьи: Эта работа была профинансирована щедрой поддержкой Фонда больницы Оттавы и грантом от Канадских институтов исследований в области здравоохранения (#448323) и быстрым грантом от фонда Thistledown для науки о COVID-19 C.S.I. T.R.J. финансируется стипендией для выпускников Онтарио и кластерной стипендией Mitacs. JP финансируется кластерной стипендией Mitacs. T.A. финансируется CIHR Banting Fellowship. Мы также хотели бы поблагодарить всех людей, которые приняли участие и сдали свои образцы крови для этого исследования.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
