Détection des anticorps neutralisants du SRAS-CoV-2 à l’aide de l’imagerie fluorescente à haut débit de l’infection à pseudovirus
Summary
Le protocole décrit ici décrit décrit une méthode rapide et efficace pour mesurer les anticorps neutralisants contre la protéine de pointe du SRAS-CoV-2 en évaluant la capacité des échantillons de sérum de convalescent à inhiber l’infection par un virus de la stomatite vésiculeuse marqué par une protéine fluorescente verte améliorée pseudotypée avec une glycoprotéine de pointe.
Abstract
Alors que la pandémie de COVID-19 causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) continue d’évoluer, il est devenu évident que la présence d’anticorps neutralisants contre le virus peut fournir une protection contre une infection future. Ainsi, alors que la création et la traduction de vaccins efficaces contre la COVID-19 se poursuivent à une vitesse sans précédent, le développement de méthodes rapides et efficaces pour mesurer les anticorps neutralisants contre le SRAS-CoV-2 deviendra de plus en plus important pour déterminer la protection à long terme contre l’infection des personnes précédemment infectées et immunisées. Cet article décrit un protocole à haut débit utilisant le virus de la stomatite vésiculeuse (VSV) pseudotypé avec la protéine de pointe sars-CoV-2 pour mesurer la présence d’anticorps neutralisants dans le sérum de convalescent de patients récemment guéris de la COVID-19. L’utilisation d’un virus pseudotypé répliquant élimine la nécessité d’une installation de niveau de confinement 3 requise pour la manipulation du SARS-CoV-2, ce qui rend ce protocole accessible à pratiquement n’importe quel laboratoire de niveau de confinement 2. L’utilisation d’un format de 96 puits permet d’exécuter de nombreux échantillons en même temps avec un court délai d’exécution de 24 h.
Introduction
En décembre 2019, un nouveau coronavirus a été identifié, que nous connaissons maintenant sous le nom de SARS-CoV-2, l’agent causal de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19)1. Le SARS-CoV-2 est un bêtacoronavirus de la famille des Coronaviridae. Ces virus enveloppés comprennent un grand génome d’ARN à sens positif et sont responsables d’infections respiratoires et intestinales chez l’homme et l’animal2. En mai 2021, plus de 157 millions de cas de COVID-19 ont été signalés dans le monde et plus de 3,2 millions de décès3. Le développement d’un vaccin efficace est devenu l’objectif principal des chercheurs du monde entier avec au moins 77 vaccins précliniques à l’étude et 90 actuellement en cours d’essais cliniques4.
Les coronavirus codent quatre protéines structurelles, dont la protéine de pointe (S), la nucléocapside (N), la protéine d’enveloppe (E) et la protéine membranaire (M). L’entrée du SARS-CoV-2 nécessite une interaction du domaine de liaison au récepteur (RBD) de S avec le récepteur hôte, l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2), et la fusion membranaire ultérieure après clivage protéolytique par la sérine protéase cellulaire hôte, la sérine 2 (TMPRSS2) transmembranaire5,6,7,8,9,10 . L’immunodominance humorale de la protéine S du SARS-CoV a déjà été rapportée et a maintenant été démontrée également pour le SARS-CoV-211,12,13. En effet, des réponses d’anticorps neutralisants contre S ont été détectées dans le sérum de convalescence de patients atteints du SRAS-CoV 24 mois après l’infection14,soulignant leur rôle essentiel dans la réponse immunitaire à long terme. La protéine S a été identifiée comme une cible vaccinale prometteuse et est ainsi devenue un composant clé de la plupart des vaccins en cours de développement15,16.
Bien que la détection rapide des anticorps neutralisants soit un aspect critique de la mise au point d’un vaccin, elle peut également faire la lumière sur le taux d’infection et la surveillance séro-épidémiologique dans les zones touchées17. Un VSV compétent en réplication pseudotypé avec la glycoprotéine SARS-CoV-2 S, à la place de la glycoprotéine VSV de type sauvage, pour étudier l’infection par le SARS-CoV-2 dans des contextes de biosécurité de niveau 2 a été gentiment donné par Whelan et ses collègues18. Le pic d’expression vsV (VSV-S) sera utilisé pour déterminer la réponse des anticorps neutralisants contre la protéine de pointe du SARS-CoV-2. Comme le VSV-S utilisé ici exprime également la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP), les foyers eGFP peuvent être détectés dans les 24 h pour quantifier l’infection, tandis que la formation de plaque peut prendre de 48 à 72 h. Résumé ici est un protocole simple et efficace pour déterminer la capacité du sérum de patient convalescent à neutraliser l’infection VSV-S-eGFP. Cette méthode peut également être facilement adaptée pour interroger d’autres thérapies potentielles qui visent à perturber l’interaction hôte-viral de la protéine SARS-CoV-2 S.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici peut être adaptée pour s’adapter à divers environnements et ressources de laboratoire, selon les besoins. Il est important de se tromper que la principale limite de ce protocole est la nécessité d’un espace de confinement de niveau 2 et d’une hotte de culture tissulaire. L’application d’un virus à ARN répliquant pseudotypé avec le pic SARS-CoV-2, tel que VSV-S-eGFP, est une alternative redoutable au virus SARS-CoV-2, qui nécessite une zone de travail de niveau de confinement 3,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le laboratoire Whelan d’avoir généreusement fourni le virus VSV-S-eGFP utilisé dans ce protocole (décrit dans Case et al. 2020). Nous remercions également les Drs Bill Cameron et Juthaporn Cowan (et leur équipe) d’avoir prélevé les échantillons de sang des patients (ID du protocole REB 20200371-01H). Les auteurs divulguent avoir reçu le soutien financier suivant pour la recherche, la paternité et/ou la publication de cet article : Ce travail a été financé par le généreux soutien de la Fondation de l’Hôpital d’Ottawa et une subvention des Instituts de recherche en santé du Canada (no 448323) et une subvention rapide de la Fondation Thistledown pour la science covid-19 au C.S.I. T.R.J. est financée par une bourse d’études supérieures de l’Ontario et une bourse Mitacs de grappe. JP est financé par une bourse Mitacs de cluster. T.A. est financé par une bourse d’interdiction des IRSC. Nous tenons également à remercier toutes les personnes qui ont participé et donné leurs échantillons de sang pour cette étude.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| ArrayScan VTI HCS | Thermo Fisher Scientific | Automated fluorescent imager | |
| carboxymethyl cellulose | Sigma | C5678 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (Powder) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| HEPES | Fisher scientific | BP-310-500 | |
| IgG Isotype Control (mouse) | Thermo Fisher Scientific | 31903 | |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 141-154 (2021).
- Burrell, C. J., Howard, C. R., Murphy, F. A. Coronaviruses. Fenner and White’s Medical Virlogy. , 437-446 (2017).
- COVID-19 Map. Johns Hopkins Coronavirus Resource Center Available from: https://coronavirus.jhu.edu/map.html (2021)
- Covid-19 vaccine tracker. The New York Times Available from: https://www.nytimes.com/interactive/2020/science/coronavirus-vaccine-tracker.html (2021)
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Letko, M., Marzi, A., Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nature Microbiology. 5, 562-569 (2020).
- Azad, T., et al. Nanoluciferase complementation-based bioreporter reveals the importance of N-linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Molecular Therapy. , (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: a Nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: Fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Cao, Z., et al. Potent and persistent antibody responses against the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein in recovered patients. Virology Journal. 7, 299 (2010).
- To, K. K. W. Temporal profiles of viral load in posterior oropharyngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS-CoV-2: an observational cohort study. The Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 565-574 (2020).
- Gao, Q., et al. Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2. Science. 369 (6499), 77-81 (2020).
- Liu, W., et al. Two-year prospective study of the humoral immune response of patients with severe acute respiratory syndrome. Journal of Infectious Diseases. 193 (6), 792-795 (2006).
- Dong, Y., et al. A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237 (2020).
- Amanat, F., Krammer, F. SARS-CoV-2 vaccines: Status report. Immunity. 52 (4), 583-589 (2020).
- Amanat, F., et al. A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans. Nature Medicine. 26 (7), 1033-1036 (2020).
- Case, J. B., et al. Neutralizing antibody and soluble ACE2 inhibition of a replication-competent VSV-SARS-CoV-2 and a clinical isolate of SARS-CoV-2. Cell Host and Microbe. 28 (3), 475-485 (2020).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Journal Pre-proof COVID-19 neutralizing antibodies predict disease severity and survival. Cell. 184 (2), 476-488 (2020).
- Zeng, C., et al. Neutralizing antibody against SARS-CoV-2 spike in COVID-19 patients, health care workers, and convalescent plasma donors. JCI insight. 5 (22), (2020).
- Whitman, J. D., et al. Evaluation of SARS-CoV-2 serology assays reveals a range of test performance. Nature Biotechnology. 38 (10), 1174-1183 (2020).
- Ainsworth, M., et al. Performance characteristics of five immunoassays for SARS-CoV-2: a head-to-head benchmark comparison. The Lancet Infectious Diseases. 20 (12), 1390-1400 (2020).
- Sharifkashani, S., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) receptor and SARS-CoV-2: Potential therapeutic targeting. European Journal of Pharmacology. 884, 173455 (2020).
- Burki, T. Understanding variants of SARS-CoV-2. The Lancet. 397 (10273), 462 (2021).
- Jayamohan, H., et al. SARS-CoV-2 pandemic: a review of molecular diagnostic tools including sample collection and commercial response with associated advantages and limitations. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 413 (1), 49-71 (2020).
- Nie, J., et al. Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by a pseudotyped virus-based assay. Nature Protocols. 15 (11), 3699-3715 (2020).
- Crawford, K. H. D., et al. Protocol and reagents for pseudotyping lentiviral particles with SARS-CoV-2 spike protein for neutralization assays. Viruses. 12 (5), 513 (2020).
