एक मल्टीप्लेक्स, मल्टीप्लेक्स ड्यूल रिपोर्टर आईजीजी और आईजीएम सार्स-सीओवी-2 बेअसर परख एक मल्टीप्लेक्स मनका आधारित प्रवाह विश्लेषण प्रणाली के लिए

Summary

मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख के लिए एक प्रवाह विश्लेषण प्रणाली जो एक दो रिपोर्टर readout प्रदान करता है मल्टीप्लेक्स सीरोलॉजिकल और एंटीबॉडी बेअसर परख के विकास के लिए इस्तेमाल किया गया था कि एक साथ सर्स-CoV-2 के लिए बेअसर IgG और IgM एंटीबॉडी को मापने कर सकते हैं ।

Abstract

COVID-19 महामारी ने सार्स-सीओवी-2 जैसे उपन्यास रोगजनकों के साथ संक्रमण के संवेदनशील और विशिष्ट सीरोलॉजिकल डिटेक्शन के लिए तेजी से उच्च-थ्रूपुट विधियों की आवश्यकता को रेखांकित किया है । मल्टीप्लेक्स सीरोलॉजिकल परीक्षण विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है क्योंकि यह एक साथ कई एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का विश्लेषण कर सकता है जो रोगजनक कवरेज का अनुकूलन करता है, और जीव और व्यक्तिगत मेजबान प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता के लिए नियंत्रण करता है। यहां हम एक सार्स-सीओवी-2 आईजीजी 3-प्लेक्स फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर आधारित परख का वर्णन करते हैं जो आईजीएम और आईजीजी एंटीबॉडी दोनों को तीन प्रमुख सार्स-सीओवी-2 एंटीजन-स्पाइक (एस) प्रोटीन, स्पाइक एंजियोटेनसिन-कन्वर्टिंग एंजाइम-2 (ACE2) रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन (आरबीडी), और न्यूक्लियोकैप्सिड (एनसीडी) दोनों का पता लगा सकता है । परख लक्षण शुरुआत से ≥21 दिनों में प्राप्त सीरम में IgG के लिए एक सार्स-CoV-2 संदर्भ परख के लिए तुलनीय प्रदर्शन किया है दिखाया गया था, लेकिन लक्षण शुरुआत से ≤५ दिनों में एकत्र नमूनों के साथ उच्च संवेदनशीलता थी । इसके अलावा, एक बेअसर परख प्रारूप में घुलनशील ACE2 का उपयोग कर, एंटीबॉडी बाध्यकारी के निषेध एस और आरबीडी के लिए प्रदर्शन किया गया था ।

Introduction

COVID-19 महामारी तेजी से विकसित करने और तेजी से विकसित करने और तेजी से लागू करने में सक्षम होने के महत्व पर बल दिया है, उच्च थ्रूपुट, उच्च प्रदर्शन सीरोलॉजिकल परीक्षण है कि निदान और सार्स-CoV-2 जैसे उपन्यास रोगजनकों की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मल्टीप्लेक्स सीरोलॉजिकल परीक्षण एक महामारी में बेहद उपयोगी हो सकता है, क्योंकि यह एक साथ कई एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का विश्लेषण कर सकता है, जो जीव में परिवर्तनशीलता और संक्रमण के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के लिए व्यापक रोगजनक कवरेज और नियंत्रण प्रदान करता है। एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट मनका आधारित परख का विकास, सार्स-सीओवी-2 आईजीजी 3फ्लेक्स (3फ्लेक्स), जो स्पाइक (एस) प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी का पता लगा सकता है, स्पाइक एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम-2 (ACE2) रिसेप्टर-बाध्यकारी डोमेन (आरबीडी), और न्यूक्लियोकैप्सिड (एनसी) सार्स-सीओवी-2 की^{रिपोर्ट}की गई थी । 3Flex लक्षण शुरुआत से ≥21 दिनों में प्राप्त सीरम के लिए एक संदर्भ सार्स-CoV-2 IgG परख के लिए तुलनीय प्रदर्शन किया है दिखाया गया था, लेकिन लक्षण शुरुआत से ≤५ दिनों में एकत्र नमूनों के साथ उच्च संवेदनशीलता थी । इसके अतिरिक्त, एक बेअसर परख प्रारूप में घुलनशील ACE2 का उपयोग कर एस और आरबीडी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी बाइंडिंग के अवरोध का प्रदर्शन किया गया था। मल्टीप्लेक्स मनका आधारित प्रौद्योगिकी को मल्टीप्लेक्स सीरोलॉजिकल परीक्षण के लिए एक सिद्ध तकनीक के रूप में व्यापक रूप से अपनाया गया है और बड़े पैमाने पर स्क्रीनिंग के लिए अलग फायदे हैं, जिनमें कम समय-से-परिणाम, छोटे नमूना आवश्यकताएं, और कम श्रम^2,3,4शामिल हैं।

हाल ही में, एक नया प्रवाह विश्लेषण उपकरण उपलब्ध हो गया है जो पिछले काम¹में प्रदर्शित सिस्टम की एक ही उच्च-प्लेक्स, उच्च-थ्रूपुट क्षमता प्रदान करता है, लेकिन दो रिपोर्टर चैनलों के अतिरिक्त लाभ के साथ। एक ही प्रतिक्रिया में दो फ्लोरोसेंट रिपोर्टर संकेतों को मापने की क्षमता प्रत्येक नमूने के लिए प्रति विश्लेषण दो परिणामों के मूल्यांकन की अनुमति देती है और आइसोटाइपिंग अनुप्रयोगों के लिए आदर्श है, जिसे आमतौर पर अलग-अलग प्रतिक्रिया कुओं में किया जाना चाहिए^5। दोहरी रिपोर्टर क्षमता आधे नमूना मात्रा आवश्यकताओं के साथ आधे के रूप में कई प्रतिक्रिया कुओं में प्रत्येक नमूने के लिए दो बार डेटा प्रदान करता है, और इस तरह एकल रिपोर्टर सिस्टम पर एक स्पष्ट लाभ है । यह अध्ययन मानक सीरोलॉजिकल परख प्रोटोकॉल का विवरण देता है और एक बेअसर परख के अनुकूलन का वर्णन करता है। इसके अतिरिक्त, इस रिपोर्ट में एक दोहरी रिपोर्टर सीरोलॉजिकल परख के लिए एकल रिपोर्टर परख के रूपांतरण का वर्णन है, और बाद में, एक दोहरी रिपोर्टर बेअसर परख, एक साथ दोनों आईजीजी और IgM isotypes के बेअसर एंटीबॉडी को मापने के लिए सार्स-CoV-2 एस, RBD, और नेकां एंटीजन के खिलाफ । परख प्रोटोकॉल का एक दृश्य सिंहावलोकन चित्र 1में प्रदान किया गया है ।

Protocol

इस अध्ययन में सार्स-सीओवी-2 नैदानिक विश्लेषणों के लिए पहले परीक्षण किए गए अवशिष्ट मानव सीरम नमूनों का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था जिसे रोचेस्टर इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया था । 1. अभिकर् ता और उपकरण वाणिज्यिक स्रोतों से कोरोनावायरस एंटीजन और मानव आईजीजी और आईजीएम प्राप्त करें। साधन विक्रेता से परख नियंत्रण (एसी) मनका सेट (45 और 220) प्राप्त करें। एसी मनका सेट 45 सिंगल रिपोर्टर चैनल (RP1) उपकरणों पर मीडियन फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) संग्रह पर नज़र रखता है। एसी मनका सेट 220 दूसरे रिपोर्टर चैनल (RP2) पर एमएफआई कलेक्शन पर नजर रखता है। युग्मन पुष्टि के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी और एंटीजन-विशिष्ट खरगोश सेरा और एंटीबॉडी का पता लगाना प्राप्त करें। बायोटिन-लेबल वाले एंटीबॉडी के साथ या तो एक स्ट्रेप्टाविडिन, आर-फाइकोरीथरिन कंजूगेट (एसएपीई) या फ्लोरोफोर सुपर ब्राइट 436 (एसएएएसबी; 405 नैनोमीटर (एनएम) पर उत्सर्जन और 436 एनएम पर उत्सर्जन के स्ट्रेप्टाविडिन कंजूगेट के साथ पहचान करें। मानव ACE2 प्रोटीन प्राप्त (यानी, सार्स रिसेप्टर) । उपयोग करने से पहले, न्यूक्लियज़-फ्री पानी (डीईपीसी-उपचारित, ऑटोक्लेव और 0.2-माइक्रोन बाँझ फ़िल्टर) में 1 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता को भंग करके लियोफिलाइज्ड एसीई 2 प्रोटीन को रीहाइड्रेट करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 96-अच्छी तरह से गैर-बाध्यकारी सतह (एनबीएस) काले फ्लैट-नीचे प्लेटों में सभी प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करें। परख इनक्यूबेशन कदम के लिए 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट एल्यूमीनियम सील टेप के साथ प्लेटों सील। परख धोने के चरणों के लिए एक चुंबकीय प्लेट विभाजक का उपयोग करें। 2. एंटीजन-युग्मित और एंटीबॉडी-युग्मित नियंत्रण मोती तैयारी सहसंयोजक युगल चुंबकीय, पॉलीस्टीरिन, और रंग-कोडित माइक्रोस्फीयर सेट (6.5-माइक्रोस्फीयर व्यास) एस, आरबीडी और एनसी एंटीजन के साथ जैसा कि कैमरून एट अलमेंवर्णित है। कोरोनावायरस एंटीजन 10 बजे/106 मोती (एस) और १०० pmol/106 मोती (आरबीडी और नेकां) में युग्मित कर रहे हैं । मानव आईजीजी या आईजीएम के साथ मिलकर मोतियों को नियंत्रित करें जैसा कि पहले वर्णित है1. आईजीजी और आईजीएम को 5 माइक्रोग्राम/10 6 मोतियों में मिलायाजाता है । युग्मन के बाद, मनका सांद्रता निर्धारित करें और वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग करके प्रत्येक स्टॉक को 1 x10 6 मोती/एमएल तक पतला करें6। खरगोश से एंटीजन-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ एंटीजन युग्मन की पुष्टि करें या सकारात्मक मानव सेरा के साथ जैसा कि कैमरून एट अल1में वर्णित है। परख के बायोटिनेलेटेड एंटी ह्यूमन आईजीजी/एसएपीई डिटेक्शन रिएजेंट्स के साथ ह्यूमन आईजीजी कपलिंग की पुष्टि करें, और एक फाइकोरीथ्रिन (पीई) के साथ आईजीएम कपलिंग-लेबल बकरी एंटी ह्यूमन आईजीएम ।नोट: कपलिंग पुष्टि प्रोटीन-विशिष्ट सीरम या एंटीबॉडी के एक शीर्षक का उपयोग करके की जाती है, क्योंकि इन अभिकर्मकों के लिए उपयोग करने के लिए इष्टतम एकाग्रता ज्ञात नहीं है। सीरम के लिए सीरियल फोल्ड तनुशंस का इस्तेमाल किया जाता है जबकि एमजी/एमएल स्टॉक्स के रूप में सप्लाई किए जाने वाले एंटीबॉडी के लिए सीरियल μg/mL तनुशन सीरीज का इस्तेमाल किया जाता है । तनु परख नियंत्रण (एसी) मोती है कि मल्टीप्लेक्स मनका घोला जा सकता है में उपयोग करने से पहले 1 x 106 मोती/एमएल की एकाग्रता के लिए दो रिपोर्टर चैनलों में MFI संग्रह की निगरानी । 3. फ्रेश मल्टीप्लेक्स मनका मिक्स तैयारी तैयार मल्टीप्लेक्स मोती 1 x 106 मोती/एमएल पर व्यक्तिगत युग्मित मनका और नियंत्रण मनका स्टॉक से हर दिन हौसले से घोला जा सकता है ।नोट: मल्टीप्लेक्स मनका घोला जा सकता है एक ५० μL मात्रा में प्रत्येक मनका क्षेत्र के लिए २,५०० मोती देने के लिए तैयार हैं । कैसे प्रतिक्रियाओं की किसी भी संख्या के लिए मल्टीप्लेक्स मनका घोला जा सकता है तैयार करने के लिए गणना Angeloni (२०२०)6द्वारा प्रकाशित ब्लॉग में वर्णित हैं । 4. नमूना कमजोर पड़ने 0.05% ट्वीन 20, 0.02% सोडियम एजाइड, और 1% बोवाइन सीरम एल्बुमिन (बीएसए) (पीबीएस-टीबीएन बफर) वाले फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 990 माइक्रोल में सीरम के 10 माइक्रोल को मिलाकर 1:100 सीरम नमूना कमजोर करने की तैयारी करें। पीबीएस-एचबीएन के 180 माइक्रोन में 1:100 कमजोर पड़ने के 20 माइक्रोन जोड़कर नमूनों को फिर से 10 गुना पतला करें।नोट: सीरम नमूनों में नकारात्मक सेरा होता है, COVID-19 महामारी से पहले २०१९ में एकत्र नमूनों से, और सार्स-CoV-2 पीसीआर पॉजिटिव रोगियों से सकारात्मक सेरा, कम और उच्च एंटीबॉडी टाइटर्स का प्रतिनिधित्व । लक्षण शुरुआत (DFSO) से ≈3 से >६० दिनों के बीच सकारात्मक नमूने एकत्र किए गए थे । सभी सीरम नमूनों और IgG छीन नकारात्मक नियंत्रण सीरा 1:1000 के रूप में नीचे वर्णित करने के लिए पतला कर रहे हैं । बेअसर परख के लिए, सेरा नीचे दिए गए बेअसर प्रोटोकॉल (सेक्शन 6 और 8) में वर्णित 1:500 को पतला कर दिया जाता है। 5. एकल रिपोर्टर सीरोलॉजिकल परख प्रोटोकॉल एक 96-अच्छी तरह से गैर-बाध्यकारी माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक सौंपे गए में मल्टीप्लेक्स मनका मिश्रण का 50 माइक्रोल जोड़ें। उपयुक्त कुओं में 1:1000 सीरम या पीबीएस-एलबीएन के पिपेट 50 माइक्रोन; कुएं में सीरम का अंतिम कमजोर पड़ने 1:2000 है। 600 आरपीएम पर मिलाते हुए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट शेखर पर एक माइक्रोप्लेट फॉयल सील और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । नीचे वर्णित प्रतिक्रिया कुओं को धोएं (पहली पोस्ट-सैंपल इनक्यूबेशन वॉश)। प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-एचबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से कवर करें और 600 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए प्लेट चुंबक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । नीचे वर्णित प्रतिक्रिया कुओं को धोएं (दूसरा पोस्ट-नमूना इनक्यूबेशन वॉश)। प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-एचबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से कवर करें और 600 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए प्लेट चुंबक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। चुंबक से प्लेट निकालें। एंटीबॉडी को 0.62 माइक्रोग्राम/एमएल और एसएपीई को 1 μg/mL तक कमजोर करके SAPE के साथ बायोटिन-एंटी-ह्यूमन आईजीजी का एक ताजा मिश्रण बनाएं। प्रत्येक कुएं में 100 माइक्रोन जोड़ें। 600 आरपीएम पर मिलाते हुए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट शेखर पर एक माइक्रोप्लेट फॉयल सील और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । नीचे वर्णित प्रतिक्रिया कुओं को धोएं (पहली पोस्ट डिटेक्शन एंटीबॉडी इनक्यूबेशन वॉश)। प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-एचबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से कवर करें और 600 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए प्लेट चुंबक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । नीचे वर्णित प्रतिक्रिया कुओं को धोएं (दूसरा पोस्ट-डिटेक्शन एंटीबॉडी इनक्यूबेशन वॉश)। प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-एचबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से कवर करें और 600 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। चुंबक से प्लेट निकालें। प्रत्येक कुएं में पीबीएस-आईबीएन के 100 माइक्रोन जोड़ें। पन्नी सील के साथ कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए हिला। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें। फिर पन्नी सील को हटा दें और उपयोगकर्ता मैनुअल के अनुसार फ्लो एनालाइजर पर प्रत्येक अच्छी तरह से 50 माइक्रोन पढ़ें। नीचे एक संक्षिप्त विवरण प्रदान किया गया है। स्क्रीन के ऊपरी बाएं कोने में ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करें और प्लेट कॉन्फ़िगरेशनपर नेविगेट करें। रन प्लेटका चयन करें । प्लेट कैरियर को बाहर निकालने के लिए रिजेक्ट आइकन का चयन करें। प्लेट वाहक पर प्लेट लोड करें और प्लेट वाहक को वापस लेने के लिए रियाव आइकन का चयन करें। प्लेट चलाने के लिए रन आइकन का चयन करें। 6. एकल रिपोर्टर बेअसर परख प्रोटोकॉल ऊपर धारा 3 में वर्णित एक ताजा मल्टीप्लेक्स मनका मिश्रण तैयार करें। तनु रोगी और नियंत्रण सीरा 1:500 इस प्रकार है। पीबीएस-एचबीएन के 990 माइक्रोन में सीरम के 10 माइक्रोन को मिलाकर सीरम 1:100 पतला करें। पीबीएस-एचबीएन के 160 माइक्रोन में 1:100 सीरम के 40 माइक्रोन जोड़कर सीरम को एक और 5 गुना पतला करें। एक 96-अच्छी तरह से गैर-बाध्यकारी माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक सौंपे गए में मल्टीप्लेक्स मनका मिश्रण का 50 माइक्रोल जोड़ें। प्रत्येक कुएं में 2 μg/mL ACE2 कमजोर पड़ने के 25 μL जोड़ें । 600 आरपीएम पर मिलाते हुए 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट शेखर पर एक माइक्रोप्लेट फॉयल सील और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और पन्नी सील हटा दें। सौंपे गए कुओं में 1:500 सीरम या पीबीएस-आईबीएन के 25 माइक्रोन जोड़ें। 600 आरपीएम पर मिलाते हुए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट शेखर पर एक माइक्रोप्लेट फॉयल सील और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। परख प्रक्रिया के शेष के लिए, ऊपर वर्णित चरणों 5.4 से 5.18.5 का पालन करें। 7. एक दोहरी रिपोर्टर आईजीजी और आईजीएम सीरोलॉजिकल परख में रूपांतरण ऊपर धारा 2 में वर्णित एंटीजन-युग्मित मोतियों को तैयार करें।नोट: मानव आईजीएम के साथ मिलकर एक अतिरिक्त मनका सेट, एंटी-आईजीएम डिटेक्शन रिएजेंट्स के अलावा के लिए निगरानी करने के साथ-साथ आरपी2 के लिए एमएफआई के संग्रह की निगरानी के लिए एक अतिरिक्त एसी मनका सेट (220) शामिल है। सभी मनका स्टॉक 1 x 106 मोती/एमएल पर मल्टीप्लेक्स मनका घोला जा सकता है में शामिल करने के लिए के रूप में नीचे वर्णित हैं । ऊपर धारा 3 में वर्णित ताजा मल्टीप्लेक्स मनका घोला जा सकता है तैयार करें। तनु सीरम के नमूने और आईजीजी-छीन लिया नकारात्मक नियंत्रण सीरा 1:1000 के रूप में ऊपर धारा 4 में वर्णित है । एक 96-अच्छी तरह से गैर-बाध्यकारी माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक सौंपे गए में मल्टीप्लेक्स मनका मिश्रण का 50 माइक्रोल जोड़ें। उपयुक्त कुओं के लिए 1:1000 सीरम या पीबीएस-आईबीएन के पिपेट 50 माइक्रोन। कुएं में सीरम का अंतिम कमजोर पड़ने 1:2000 है। 600 आरपीएम पर मिलाते हुए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट शेखर पर एक माइक्रोप्लेट फॉयल सील और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । नीचे वर्णित प्रतिक्रिया कुओं को धोएं (पहली पोस्ट-सैंपल इनक्यूबेशन वॉश)। प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-एचबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से कवर करें और 600 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए प्लेट चुंबक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । पीबीएस-एचबीएन (दूसरा पोस्ट-सैंपल इनक्यूबेशन वॉश) के साथ प्रतिक्रिया कुओं को फिर से धोएं, ठीक के रूप में कदम 7.10.1-7.10.5 में ऊपर वर्णित है । चुंबक से प्लेट निकालें। रिएजेंट्स के आवश्यक संयोजन के साथ एक ताजा डिटेक्शन रिएजेंट मिश्रण करें और प्रत्येक अच्छी तरह से 50 माइक्रोन या 100 माइक्रोन जोड़ें।नोट: डिटेक्शन रिएजेंट मिक्स, जिसमें एंटी-ह्यूमन आईजीजी को शानदार वायलेट ४२१ रिपोर्टर डाई (बीवी; ४०५ एनएम पर उत्तेजन और ४२१ एनएम पर उत्सर्जन) का उपयोग उपलब्ध स्टॉक रिएजेंटों की सीमित मात्रा के कारण ५० माइक्रोन/वेल पर किया गया था । अन्य सभी डिटेक्शन रिएजेंट मिक्स का उपयोग 100 माइक्रोन/वेल पर किया जाता है। 600 आरपीएम पर मिलाते हुए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट शेखर पर एक माइक्रोप्लेट फॉयल सील और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । पीबीएस-एचबीएन (एंटीबॉडी इनक्यूबेशन का पता लगाने के बाद पहला धोने) के साथ नीचे वर्णित प्रतिक्रिया कुओं को धोएं। प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-एचबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से कवर करें और 600 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर प्लेट को बनाए रखते समय, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से प्लेट को एक अपशिष्ट कंटेनर पर उलटा करें, और धीरे-धीरे कुओं से सुपरनैंट को झटका दें। शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । प्रतिक्रिया कुओं को पीबीएस-एचबीएन (एंटीबॉडी इनक्यूबेशन का पता लगाने के बाद दूसरा धोने) के साथ फिर से धोएं, ठीक के रूप में कदम 7.17.1-7.17.5 में ऊपर वर्णित है । चुंबक से प्लेट निकालें। प्रत्येक कुएं में पीबीएस-आईबीएन के 100 माइक्रोन जोड़ें। पन्नी सील के साथ कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए हिला। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें। फिर पन्नी सील को हटा दें और चरण 5.18.1-5.18-5 में वर्णित प्रवाह विश्लेषक पर प्रत्येक अच्छी तरह से 50 माइक्रोन पढ़ें। 8. दोहरी रिपोर्टर बेअसर परख के लिए रूपांतरण ऊपर चरण 7.1 में वर्णित युग्मित मोतियों का उपयोग करें। चरण 7.2 में वर्णित एक ताजा मल्टीप्लेक्स मनका मिश्रण तैयार करें। सीरम के नमूने और आईजीजी-छीन लिया नकारात्मक नियंत्रण सीरा को इस प्रकार 1:500 पतला किया जाता है। पीबीएस-एचबीएन के 990 माइक्रोन में सीरम के 10 माइक्रोन मिलाकर 1:100 कमजोर पड़ने की तैयारी करें। 1:100 नमूनों को 1:100 कमजोर पड़ने के 40 μL को जोड़कर पीबीएस-एचबीएन के 160 माइक्रोन में 5 गुना पतला करें। एक 96-अच्छी तरह से गैर-बाध्यकारी माइक्रोटिटर प्लेट के प्रत्येक सौंपे गए में मल्टीप्लेक्स मनका मिश्रण का 50 माइक्रोल जोड़ें। प्रत्येक कुएं में 2 μg/mL ACE2 कमजोर पड़ने के 25 μL जोड़ें । 600 आरपीएम पर मिलाते हुए 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट शेखर पर एक माइक्रोप्लेट फॉयल सील और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और पन्नी सील हटा दें। सौंपे गए कुओं में 1:500 सीरम या पीबीएस-आईबीएन के 25 माइक्रोन जोड़ें। 600 आरपीएम पर मिलाते हुए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट शेखर पर एक पन्नी सील और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर बनाए रखी थाली के साथ, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से एक बेकार कंटेनर पर थाली उलटा, और धीरे से कुओं से बाहर supernatant झटका । शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । नीचे वर्णित प्रतिक्रिया कुओं को धोएं (पहली पोस्ट नमूना इनक्यूबेशन धोना)। प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-एचबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से कवर करें और 600 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर बनाए रखी थाली के साथ, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से एक बेकार कंटेनर पर थाली उलटा, और धीरे से कुओं से बाहर supernatant झटका । शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । पीबीएस-एचबीएन (दूसरे पोस्ट-सैंपल इनक्यूबेशन वॉश) के साथ प्रतिक्रिया कुओं को फिर से धोएं, ठीक के रूप में कदम 8.13.1-8.13.5 में ऊपर वर्णित है । चुंबक से प्लेट निकालें। रिएजेंट्स के आवश्यक संयोजन के साथ एक ताजा डिटेक्शन रिएजेंट मिश्रण करें और प्रत्येक अच्छी तरह से 50 माइक्रोन या 100 माइक्रोन जोड़ें।नोट: बीवी रिपोर्टर डाई के लिए संयुग्मित एंटी-ह्यूमन आईजीजी युक्त डिटेक्शन रीएजेंट मिक्स का उपयोग 50 μL/अच्छी तरह से उपलब्ध स्टॉक रिएजेंट्स की मात्रा सीमित करने के कारण किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)। अन्य सभी डिटेक्शन रिएजेंट मिक्स का उपयोग 100 माइक्रोन/वेल पर किया जाता है। 600 आरपीएम पर मिलाते हुए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट शेखर पर एक माइक्रोप्लेट फॉयल सील और इनक्यूबेट के साथ प्लेट को कवर करें। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर बनाए रखी थाली के साथ, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से एक बेकार कंटेनर पर थाली उलटा, और धीरे से कुओं से बाहर supernatant झटका । शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । नीचे वर्णित प्रतिक्रिया कुओं को धोएं (पहले एंटीबॉडी इनक्यूबेशन का पता लगाने के बाद था)। प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-एचबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से कवर करें और 600 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर बनाए रखी थाली के साथ, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से एक बेकार कंटेनर पर थाली उलटा, और धीरे से कुओं से बाहर supernatant झटका । शोषक कागज पर थाली दाग जबकि अभी भी चुंबक पर थाली पकड़े । प्रतिक्रिया कुओं को पीबीएस-एचबीएन (एंटीबॉडी इनक्यूबेशन का पता लगाने के बाद दूसरा धोने) के साथ फिर से धोएं, ठीक के रूप में कदम 8.21.1-8.21.5 में ऊपर विस्तृत । प्लेट चुंबक से प्लेट निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस-एचबीएन के 150 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को एक ताजा पन्नी सील से कवर करें और 600 आरपीएम पर 2 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर हिलाएं। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें और प्रतिक्रिया मिश्रण से मोतियों को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए चुंबकीय प्लेट विभाजक पर रखें। चुंबक पर बनाए रखी थाली के साथ, पन्नी सील को हटा दें, ध्यान से एक बेकार कंटेनर पर थाली उलटा, और धीरे से कुओं से बाहर supernatant झटका । चुंबक से प्लेट निकालें। प्रत्येक कुएं में पीबीएस-आईबीएन के 100 माइक्रोन जोड़ें। पन्नी सील के साथ कवर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए हिला। प्लेट शेकर से प्लेट निकालें। फिर पन्नी सील को हटा दें और चरण 5.18.1-5.18-5 में वर्णित प्रवाह विश्लेषक पर प्रत्येक अच्छी तरह से 50 माइक्रोन पढ़ें।

Representative Results

एकल रिपोर्टर सीरोलॉजिकल परख का अनुकूलन।सभी सार्स-CoV-2 एंटीजन के लिए युग्मन रणनीति कैमरून, एट अल, 20201 और ऊपर चरण 2.1 में वर्णित है। युग्मन पुष्टि के लिए रणनीति ऊपर चरण 2.3 में वर्णित है। एक कुशल युग्मन के लिए, औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता (एमएफआई) मूल्यों को कोई सीरम/कोई एंटीबॉडी नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया (ओं) से काफी अधिक होना चाहिए और पता लगाने के अभिकर्मक की मात्रा कम होने के साथ एमएफआई संकेत को कम करने की एक खुराक प्रतिक्रिया प्रदर्शित करनी चाहिए । लगभग 1,000 एमएफआई इकाइयों या पृष्ठभूमि पर अधिक एमएफआई एमएफआई आम तौर पर कुशल प्रोटीन युग्मन का संकेत देता है और उपयोग किए गए डिटेक्शन रिएजेंट की एकाग्रता और विशिष्टता पर निर्भर करता है। इस विधि का उपयोग करके, एस, आरबीडी और एनसी एंटीजन कपलिंग की पुष्टि दो बहुत सारे मोतियों(चित्रा 2)के लिए परीक्षण किया गया था। सभी एंटीजन के लिए एमएफआई संकेत पृष्ठभूमि एमएफआई की तुलना में काफी अधिक थे और पता लगाने वाले अभिकर् थों के टिटरेशन के साथ एक खुराक प्रतिक्रिया दिखाई। आंकड़ों में दो अलग-अलग बहुत सारे युग्मित मोतियों के बीच एमएफआई के स्तर की अच्छी प्रजनन क्षमता भी दिखाई गई। एकल रिपोर्टर परख का अनुकूलन कैमरून, एट अल, 20201में वर्णित किया गया था। प्रत्येक एंटीजन का परीक्षण विभिन्न युग्म सांद्रता पर किया गया था, जिसमें उच्च, मध्यम, निम्न और नकारात्मक नमूनों का प्रतिनिधित्व करने वाले कई सीरम नमूनों के विभिन्न कमजोर पड़ने थे। इसके अलावा, क्योंकि परख के उपाय IgG titers, एक IgG छीन सीरम एक अतिरिक्त नकारात्मक नमूने के रूप में इस्तेमाल किया गया था । विभिन्न एंटीजन युग्मन स्तरों के साथ एक प्रतिनिधि नमूना कमजोर पड़ने श्रृंखला के परिणाम चित्र 3में दिखाए गए हैं । इस प्रारंभिक कमजोर पड़ने श्रृंखला का परीक्षण प्रतिनिधि एंटीजन-विशिष्ट और पृष्ठभूमि एमएफआई स्तरों की संभावित श्रृंखला प्राप्त करने के लिए डिटेक्शन रिएजेंट्स की एक निश्चित एकाग्रता के साथ किया गया था। इन आंकड़ों से, अतिरिक्त नमूना कमजोर पड़ने पर्वतमाला और एंटीजन युग्मन स्तर निर्धारित किए गए थे और अतिरिक्त नमूनों (डेटा नहीं दिखाए गए) के साथ आगे परीक्षण किया गया था। इसके बाद, विभिन्न सीरम कमजोर पड़ने और एंटीजन कपलिंग स्तरों के साथ उपयोग के लिए डिटेक्शन रिएजेंट की एकाग्रता को अनुकूलित किया गया था। 6 सकारात्मक और 2 नकारात्मक नमूनों का उपयोग कर प्रतिनिधि डेटा चित्र 4में दिखाए गए हैं । कई सौ नकारात्मक पूर्व COVID-19 सीरम नमूनों के साथ अतिरिक्त परीक्षण के बाद, अंतिम इष्टतम एंटीजन युग्मन स्तर और पता लगाने रीजेंट सांद्रता अंतिम परख प्रोटोकॉल के लिए चुना गया था, के रूप में धारा 5 में वर्णित है । एक ही रिपोर्टर बेअसर परख के लिए रूपांतरणएक बेअसर परख करने के लिए एकल रिपोर्टर सीरोलॉजिकल परख का रूपांतरण सीरम नमूना जोड़ने से पहले मोतियों के साथ ACE2 (एक प्रतिस्पर्धी अभिकर्धन के रूप में) का उपयोग करते हुए एक इनक्यूबेशन कदम जोड़कर हासिल किया गया था। जोड़ा गई ACE2 की मात्रा को टिटरिंग करके, एस और आरबीडी एंटीजन के लिए बाध्यकारी आईजीजी का अवरोध देखा गया, जैसा कि चित्र 5में दिखाया गया है। जबकि 11 रोगी सीरा में आईजीजी के अलग-अलग टाइटर्स थे, प्रत्येक ने ACE2 एकाग्रता बढ़ाने के साथ एमएफआई सिग्नल में महत्वपूर्ण कमी दिखाई। जैसा कि उम्मीद थी, ACE2 केवल एस और आरबीडी के एमएफआई संकेतों को प्रभावित करता है, लेकिन नेकां एंटीजन नहीं। सभी नमूनों के लिए 0 μg/mL ACE2 के सापेक्ष प्रतिशत अवशिष्ट एमएफआई संकेत चित्रा 6में दिखाया गया है । अधिकांश नमूनों के लिए, एसीई 2 एकाग्रता बढ़ाने के साथ एस और आरबीडी के लिए एक सिग्नल हानि >30% मनाया गया था। जैसा कि उम्मीद थी, एनसी सिग्नल पर एसीई2 का कोई असर नहीं हुआ। एक दोहरी रिपोर्टर IgG और IgM सीरोलॉजिकल परख में रूपांतरणड्यूल रिपोर्टर आईजीजी और आईजीएम परख के लिए स्टैंडर्ड सिंगल रिपोर्टर परख की शर्तों का इस्तेमाल दो रिपोर्टर चैनलों के लिए अलग एंटीबॉडी और रिपोर्टर कॉम्बिनेशन को परखने के लिए किया गया । RP1 चैनल पीई जैसे रिपोर्टर रंगों के लिए “नारंगी” फ्लोरेसेंस का पता लगाने के साथ पिछले प्रवाह विश्लेषण उपकरणों के समान है। दूसरा चैनल, RP2, एक बैंगनी उत्तेजन लेजर है कि 421-441 एनएम रेंज में उत्सर्जन स्पेक्ट्रा चोटियों के साथ ४०२ एनएम पर उत्साहित रंगों की “नीली” फ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है रोजगार । धारा 6 में विस्तृत मानक 2,000 गुना नमूना कमजोर पड़ने और इनक्यूबेशन शर्तों के साथ विभिन्न सांद्रता पर कई अलग-अलग मानव विरोधी आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी संयोजनों का परीक्षण किया गया था। आरपी2 चैनल के लिए डाइलाइट 405 रिपोर्टर डाई (डीएल 405; 400 एनएम पर उत्सर्जन और 420 एनएम पर उत्सर्जन) के लिए एंटी-आईजीएम का प्रारंभिक परीक्षण 5 से >60 दिनों तक डीएफएसओ के साथ 11 पीसीआर-पॉजिटिव नमूनों के सेट का उपयोग करके किया गया था, और एक आईजीजी-छीन सीरम नमूना। इस डिटेक्शन रिएजेंट ने आरपी2 चैनल में उच्च संकेत का उत्पादन नहीं किया जैसा कि चित्रा 7ए,बी, सीमें दिखाया गया है । उच्च आईजीएम आरपी2 एमएफआई वाले नमूनों के लिए, आरबीडी और एनसी(चित्रा 7B,सी)के लिए उच्चतम संकेत देखे गए। जबकि आईजीएम टाइटर्स को इस समय कुछ नमूनों में ऊंचा किया जाना चाहिए, मनाया गया एमएफआई का स्तर आईजीएम डिटेक्शन रिएजेंट के साथ १४० एमएफआई इकाइयों से अधिक नहीं था । इसके अलावा, आईजीएम के लिए नियंत्रण मनका एमएफआई के लिए एक महत्वपूर्ण गतिशील रेंज का अभाव था जब डीएल 405 का उपयोग करते हुए एक पीई-लेबल एंटी-आईजीएम आरपी1 रिपोर्टर की तुलना में एंटी-आईजीएम आरपी1 रिपोर्टर का उपयोग एक ही सांद्रता(चित्रा 7D)में उपयोग किया जाता है। क्योंकि आईजीएम के लिए एक उपयुक्त RP2 रिपोर्टर-लेबल डिटेक्शन रिएजेंट उपलब्ध नहीं था, इसलिए एसएएएसबी के साथ मूल बायोटिन एंटी-आईजीजी का आरपी2 चैनल में उपयोग के लिए परीक्षण किया गया था। एसएएएसबी के साथ आरपी2 चैनल में आईजीजी के लिए सिग्नल में एसएपीई के साथ एक ही गतिशील रेंज नहीं थी, लेकिन इसमें अभी भी एस, आरबीडी और एनसी(चित्रा 8)के लिए आईजीजी टाइटर्स को मापने के लिए एक उपयुक्त रेंज थी। इन आंकड़ों के कारण अलग-अलग आरपी1 आईजीएम और आरपी2 आईजीजी डिटेक्शन रीएजेंट कॉम्बिनेशन का परीक्षण किया गया, जैसा कि नीचे बताया गया है । दोहरे रिपोर्टर बेअसर परख में रूपांतरणसीरम नमूना जोड़ने से पहले, ACE2 और मोतियों के साथ एक इनक्यूबेशन कदम जोड़कर दोहरी रिपोर्टर सीरोलॉजिकल परख को बेअसर परख में बदल दिया गया था। 16 μg/ml से शुरू ACE2 की एक 2 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला का इस्तेमाल किया गया था, और फिर 11 नमूनों के सेट के साथ परीक्षण किया और ऊपर वर्णित के रूप में सेरा छीन लिया । इसके अलावा, आरपी1 आईजीएम और आरपी2 आईजीजी डिटेक्शन एंटीबॉडी मिक्स के 3 विभिन्न संयोजनों का परीक्षण 11 नमूनों के एक सेट पर किया गया और सीरम नियंत्रण छीन लिया गया। इष्टतम होने के लिए निर्धारित अंतिम संयोजन और अभिकर्ण सांद्रता तालिका 1में विस्तृत हैं। आईजीजी डिटेक्शन के लिए मूल सिंगल रिपोर्टर परख में इस्तेमाल होने वाले बायोटिन एंटी ह्यूमन आईजीजी/एसएएएसबी का परीक्षण बीवी रिपोर्टर डाई के लिए एक और एंटी-आईजीजी के साथ किया गया । जबकि बीवी संजूगेट में उच्च आरपी 2 एमएफआई सिग्नल थे, आईजीजी टिटर के लिए एमएफआई सिग्नल तीव्रता ACE2 titrations(चित्रा 9A,सी, ई)में भिन्न थी। बायोटिन एंटी-ह्यूमन आईजीजी/एसएएएसबी कॉम्बिनेशन में बीवी कंजूगेट की तुलना में ACE2 टिटरेशन में अधिक सुसंगत एमएफआई सिग्नल कम था, एक खुराक प्रतिक्रिया का प्रदर्शन, हालांकि एमएफआई का स्तर कम था । ACE2 सांद्रता में बीवी कंजूगेट द्वारा संकेत उतार-चढ़ाव ने बायोटिन एंटी-ह्यूमन आईजीजी/एसएएएसबी संयोजन(चित्रा 9B,D, F)की तुलना में आईजीजी टाइटर्स की सीमा में ACE2 द्वारा प्रतिशत अवरोध का निर्धारण करने में भी हस्तक्षेप किया । कम एमएफआई संकेतों वाले नमूने, जैसे डीएफएसओ 3 नमूना, इन अभिकर् यों के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने या आईजीजी बेअसर क्षमता को मापने के लिए उच्च पर्याप्त टाइटर्स नहीं हैं। RP1 चैनल में IgM titers का निर्धारण करने के लिए, एक पीई-संयुग्म विरोधी IgM एक मानव विरोधी IgM DyLight ५४९ रिपोर्टर डाई (डीएल ५४९; ५६२ एनएम पर उत्तेजन और ५७६ एनएम पर उत्सर्जन) तालिका 1में सूचीबद्ध सांद्रता पर संयुग्म की तुलना में किया गया था । इन दो अभिकर्मकों में से, पीई एंटी-आईजीएम ने परीक्षण किए गए नमूनों के लिए डीएल 549 एंटी-ह्यूमन आईजीएम द्वारा उत्पन्न लोगों की तुलना में उच्च एमएफआई प्रदर्शित किया(चित्रा 9A,सी, ई)। इन अभिवार्जियों के अलावा मापने वाले आईजीएम नियंत्रण मनका में पीई एंटी-आईजीएम के लिए ≈17,000 और डीएल 549 संजूगेट के लिए 2,723 का अलग-अलग औसत एमएफआई था। यहां तक कि इन मतभेदों के साथ, एमएफआई पर विभिन्न ACE2 सांद्रता का प्रभाव डीएल 549 संजूगेट के साथ औसत दर्जे का था। IgM बाध्यकारी के ACE2 प्रतिशत निषेध का निर्धारण करने के लिए, दो IgM डिटेक्शन रिएजेंट्स(चित्रा 9B,D, F)के बीच एक मामूली लेकिन तुच्छ अंतर था । मेल संवाददाता अच्छी तरह से अंतिम एकाग्रता (μg/mL) आरपी1 आरपी2 1 पीई एंटी-आईजीएम 2 – बायोटिन-आईजी – 0.62 एसएएएसबी – 4 2 डाइलाइट 549 एंटी-ह्यूमन आईजीएम 1 – शानदार वायलेट 421 एंटी ह्यूमन आईजीजी – 1 3 डाइलाइट 549 एंटी-ह्यूमन आईजीएम 1 – बायोटिन-आईजी – 0.62 एसएएएसबी – 4 तालिका 1: RP1 और RP2 रिपोर्टर डाई संयोजनों की सूची का परीक्षण किया गया। आईजीजी और आईजीएम टाइटर्स को मापने के लिए कई अलग-अलग RP1 और RP2 रिपोर्टर रंगों का मूल्यांकन किया गया। ऊपर दिखाए गए तीन संयोजनों को अलग-अलग आरपी1 डिटेक्शन मोड पर और बेअसर परख के अनुकूलन के लिए परीक्षण किया गया था। एसएएसबी का उपयोग करके आरपी2 संयोजनों के लिए, बायोटिनेलेटेड डिटेक्शन एंटीबॉडी और एसएएएसबी के लिए सांद्रता दिखाई जाती है। * अंतिम एकाग्रता अच्छी तरह से प्रतिक्रिया में अंतिम एकाग्रता का प्रतिनिधित्व करता है। चित्र 1:मुख्य परख प्रोटोकॉल चरणों को हाइलाइट करते हुए फ्लोचार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 2:एंटीजन युग्मन की पुष्टि। एंटीजन १००, 10 और 1 pmol/106 मोतियों में युग्मित थे । एस और आरबीडी एंटीजन के लिए, खरगोश विरोधी एस सीरा का उपयोग किया गया था और पीई एंटी-रैबिट आईजीजी के साथ इसका पता लगाया गया था। नेकां के लिए एक प्रोटीन जी-शुद्ध खरगोश पॉलीक्लोनल एंटी एनसी का इस्तेमाल किया गया । मोतियों के लिए टिट्रेशन घटता 10 पीएमओएल एस(ए),100 पीएमओएल आरबीडी(बी)और 100 पीएमओएल एनसी(सी)के साथ मिलकर दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्र 3:विभिन्न एंटीजन कपलिंग स्तरों के साथ सीरम कमजोर पड़ने का अनुकूलन। उच्च, मध्यम, कम, और नकारात्मक नमूनों का प्रतिनिधित्व सीरम नमूनों अलग pmol एंटीजन/106 मनका युग्मन के साथ परीक्षण किया गया । धारा 5 में वर्णित परख प्रोटोकॉल का उपयोग करके एंटीजन-युग्मित मोतियों के मल्टीप्लेक्स मिश्रण के साथ 4 गुना सीरम टाइट्रेशन का परीक्षण किया गया था। एस(ए),आरबीडी(बी)और एनसी(सी)के लिए टिटरेशन वक्र्स के एमएफआई मूल्यों को दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 4:इष्टतम सीरम कमजोर पड़ने और पता लगाने अभिकर्षक का निर्धारण। आठ सीरम नमूनों, नकारात्मक रोगियों (2 नमूनों) और कम से उच्च सकारात्मक (6 नमूनों) सहित, तीन अलग पता लगाने अभिकर्षक सांद्रता के साथ अतिरिक्त सीरम कमजोर पड़ने पर परीक्षण किया गया । एमएफआई के नतीजे एस(ए),आरबीडी(बी)और एनसी(सी)के लिए दिखाए जाते हैं । इन और अन्य आंकड़ों (दिखाए नहीं) के आधार पर, 1:2,000 का नमूना कमजोर पड़ने और 0.62 माइक्रोग्राम/एमएल की बायोटिन डिटेक्शन एंटीबॉडी एकाग्रता का चयन किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 5:एकल रिपोर्टर बेअसर परख का अनुकूलन। एक बेअसर एंटीबॉडी का पता लगाने परख के लिए एकल रिपोर्टर सीरोलॉजिकल परख का संशोधन एक प्रतियोगी के रूप में ACE2 के साथ एक इनक्यूबेशन कदम जोड़कर किया गया था, जैसा कि धारा 6 में वर्णित है । 11 नमूनों का एक सेट, कम से लेकर उच्च सकारात्मक टाइटर सेरा, और एक आईजीजी धारीदार सीरम नमूने 4 μg/mL पर शुरू ACE2 की एक दो गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला के साथ परीक्षण किया गया, मानक परख शर्तों का उपयोग कर । ACE2 सांद्रता की इस सीमा के पार, एमएफआई में कमी एस(ए)और आरबीडी(बी)के लिए बढ़ी हुई ACE2 के साथ देखा जा सकता है, लेकिन नेकां(सी)के लिए नहीं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 6:ACE2 के साथ संकेत का प्रतिशत अवरोध। 11 नमूनों (चित्र 4से) के सेट के लिए प्रतिशत अवशिष्ट संकेत दिखाए गए हैं । प्रत्येक नमूने के लिए, इसके आईजीजी टिटर की परवाह किए बिना, उच्चतम ACE2 एकाग्रता पर एस(ए)और आरबीडी(बी)के लिए ≥30% एमएफआई सिग्नल की अधिकतम कमी हासिल की गई थी। नेकां एंटीजन(सी)के लिए एसीई 2 परीक्षण की किसी भी राशि के साथ संकेत का कोई महत्वपूर्ण अवरोध नहीं था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 7:RP2 IgM डिटेक्शन रिएजेंट के रूप में डाइलाइट 405 एंटी-आईजीएम का परीक्षण। 11 नमूनों और आईजीजी-छीन लिया सेरा का एक सेट एक RP2 डिटेक्शन रिएजेंट के रूप में डीएल ४०५-संयुग्म विरोधी IgM परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया । आरी2 आईजीएम एमएफआई सिग्नल्स फॉर एस(ए),आरबीडी(बी)और एनसी(सी)को दिखाया गया है । किसी भी नमूने के साथ किसी भी एंटीजन के लिए उच्चतम एमएफआई सिग्नल नमूना एच(बी)के साथ आरबीडी के लिए लगभग 140 एमएफआई इकाइयां थीं। यहां तक कि आईजीएम कंट्रोल मनका सेट पर सिग्नल पूरे एंटीबॉडी टिटर रेंज में आरपी2 चैनल में 1,000 एमएफआई से कम था और आरपी 1 चैनल(डी)में पीई एंटी-आईजीएम डिटेक्शन एंटीबॉडी के साथ देखी गई बढ़ी हुई गतिशील रेंज नहीं दिखा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 8:बायोटिन एंटी-आईजीजी के साथ आरपी2 रिपोर्टर के रूप में एसएएएसबी का अनुकूलन। 11 नमूनों और आईजीजी-छीन लिया सेरा का एक सेट मानक ०.६२ μg/mL बायोटिन एंटी-आईजीजी के साथ एसएएसबी की एक कमजोर पड़ने श्रृंखला का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया गया । आरपी2 चैनल फॉर एस(ए),आरबीडी(बी)और एनसी(सी)में परिणामी आईजीजी एमएफआई दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । चित्रा 9:RP1 IgM और RP1 IgG डिटेक्शन घोला जा सकता है के तीन अलग-अलग संयोजनों की तुलना। तीन अलग पहचान एंटीबॉडी घोला जा सकता है 11 नमूनों और आईजीजी छीन सेरा पर परीक्षण किया गया । उपयोग किए गए संयोजन और अंतिम सांद्रता तालिका 1में वर्णित हैं। सभी नमूनों को 2 गुना ACE2 कमजोर पड़ने के साथ परीक्षण किया गया, जो 16 μg/mL से शुरू होता है । 3, 12, और 30 दिनों के DFSO में नमूनों के लिए डेटा दिखाया जाता है । RP1 IgM (ऑरेंज) और RP2 IgG (ब्लू) के लिए MFI संकेतों को ए (DFSO 3), सी (DFSO 12), और ई (DFSO 30) में दिखाया गया है । ACE2 प्रतिशत अवशिष्ट एमएफआईएस को बी (डीएफएसओ 3), डी (डीएफएसओ 12), और एफ (डीएफएसओ 30) में दिखाया गया है। कोई ACE2 नियंत्रण की तुलना में >30% की कमी का प्रतिनिधित्व करने वाले संकेतों को हल्के हरे रंग पर प्रकाश डाला जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

इस अध्ययन ने एक मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट माइक्रोस्फीयर परख, 3फ्लेक्स की कार्यक्षमता का विस्तार किया, जो सार्स-सीओवी-2¹द्वारा संक्रमण के लिए आईजीजी प्रतिक्रिया का गुणात्मक आकलन करता है। जबकि COVID-19 के लिए कई सीरोलॉजिकल परख एक ही एंटीजन का पता लगाते हैं, यह परख एक साथ एस, आरबीडी और एनसी एंटीजन का मूल्यांकन करती है, और इसमें एक आंतरिक एंटीबॉडी आइसोटाइप नियंत्रण⁷शामिल है। इसके अलावा, ACE2 का उपयोग सार्स-सीओवी-2 को बेअसर एंटीबॉडी टाइटर्स का पता लगाने के लिए एक संकेतक के रूप में किया जाता है।

संक्रमित और टीका लगाए गए व्यक्तियों के बीच प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के साथ भेदभाव करने के लिए भविष्य में बहु-एंटीजन परख विशेष रूप से उपयोगी हो सकती है। सार्स-CoV-2 के साथ, यदि केवल एस और आरबीडी एंटीबॉडी का मूल्यांकन किया जाता है, तो यह विचार करना असंभव होगा कि क्या यह पिछले संक्रमण के कारण था या टीकाकरण एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के लिए। वर्तमान में उपयोग में आने वाले टीकों में से कोई भी एनसी एंटीजन को लक्षित नहीं करता है, इसलिए एस/आरबीडी और एनसी एंटीजन का मूल्यांकन करके, पिछले वायरल संक्रमण (एनसी-और एस/आरबीडी-पॉजिटिव) को टीकाकरण प्रतिक्रिया (एस/आरबीडी-पॉजिटिव) से अलग करना संभव है; नेकां नकारात्मक) ।

वर्तमान अध्ययन में, 3फ्लेक्स सीरोलॉजिकल और बेअसर परख (वर्ग 5 और 6) को एक नए दोहरे रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण उपकरण (वर्ग 7 और 8) पर स्थानांतरित कर दिया गया था। मनका आधारित मल्टीप्लेक्स परख के लिए विशिष्ट इम्यूनोसे प्रोटोकॉल मानक एलिसा प्रोटोकॉल के समान हैं, नमूना इनक्यूबेशन के लिए तुलनीयकदम के बाद, एंटीबॉडी का पता लगाने इनक्यूबेशन/ पिछले अध्ययनों से यह भी पता चला है कि कैसे मानक एलिसा परख को मनका आधारित मल्टीप्लेक्सिंग प्लेटफॉर्म⁹में स्थानांतरित किया जा सकता है ।

परख प्रोटोकॉल मूल पूर्ववर्ती एकल रिपोर्टर साधन से नए दोहरे रिपोर्टर प्रणाली के लिए स्थानांतरित किया जा सकता है, के रूप में परीक्षण के नमूनों और नियंत्रण के लिए प्राप्त परिणामों द्वारा दिखाया गया है(चित्रा 4 और चित्रा 5)। सीरोलॉजिकल परख में, सभी सकारात्मक सीरम नमूनों ने एक उच्च नमूना कमजोर पड़ने और कम पहचान एंटीबॉडी एकाग्रता दोनों के अनुरूप संकेत में एक विशेषता खुराक-उत्तरदायी कमी का प्रदर्शन किया, जबकि नकारात्मक नमूनों के लिए संकेत पृष्ठभूमि के स्तर पर बने रहे। इसी तरह, बेअसर परख के लिए, एस और आरबीडी के लिए संकेतों को कम करना, लेकिन नेकां नहीं, ACE2 प्रतियोगी की बढ़ती सांद्रता से मेल खाती है, जबकि आईजीजी छीन लिया सीरम ACE2 के अलावा से बहुत कम प्रभावित था । सीरम नमूने के अलावा (जैसा कि वर्ग 6 और 8 में वर्णित) के अलावा से पहले 2 मिनट के लिए ACE2 के साथ मोतियों को पूर्व-इनक्यूबेटिंग करना, एक ही समय में ACE2 और सीरम के साथ मोतियों के संयोजन की तुलना में भी किया गया था और परिणामों में थोड़ा अंतर उत्पन्न किया गया था (डेटा नहीं दिखाया गया)। हालांकि, क्योंकि मोतियों के साथ प्राप्त परिणाम प्लस ACE2 पूर्व इनक्यूबेशन कदम अधिक सुसंगत थे, यह अंतिम प्रक्रिया बेअसर परख प्रोटोकॉल (वर्ग 6 और 8) के लिए अपनाया गया था ।

क्योंकि दोहरी रिपोर्टर प्रणाली एक दूसरे फ्लोरोसेंट रिपोर्टर चैनल को शामिल किया गया है, दोनों परख isotyping परख में परिवर्तित करने के लिए एक साथ दोनों IgG और IgM प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए किया गया । फ्लो एनालाइजर की दोहरी रिपोर्टर कार्यक्षमता प्रत्येक नमूने के लिए मल्टीप्लेक्स में प्रत्येक विश्लेषण के लिए दो रिपोर्टर डिटेक्शन रिएजेंट्स से फ्लोरोसेंट संकेतों के संग्रह की अनुमति देती है, जो एक परख में प्रति नमूने उत्पन्न डेटा को प्रभावी ढंग से दोगुना कर देता है। दोहरे रिपोर्टर परख प्रोटोकॉल के विकास और अनुकूलन के लिए, कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिपोर्टर रंगों और डिटेक्शन एंटीबॉडी का मूल्यांकन नए RP2 चैनल(चित्रा 7 और चित्रा 8)के लिए किया गया था ताकि उपलब्ध सर्वोत्तम विकल्प (एस) का निर्धारण किया जा सके। डीएल 405 रिपोर्टर डाई के साथ संयुग्म विरोधी आईजीएम एंटीबॉडी ने आरपी2 चैनल(चित्रा 7)में अच्छा प्रदर्शन नहीं किया, इसलिए एसएएएसबी के साथ बायोटिन एंटी-आईजीजी का मूल्यांकन बाद में आरपी2 चैनल(चित्रा 8)में पता लगाने के लिए किया गया। आईजीजी और आईजीएम बेअसर एंटीबॉडी का एक साथ पता लगाने के लिए सर्वश्रेष्ठ प्रदर्शन संयोजन निर्धारित करने के लिए दोहरे रिपोर्टर बेअसर परख(तालिका 1 और चित्रा 9)में RP1 और RP2 डिटेक्शन रिएजेंट्स के तीन संयोजनों की तुलना की गई । जबकि पीई-एंटी आईजीएम और डीएल 549 एंटी-आईजीएम का उपयोग करके आरपी 1 चैनल के बीच सिग्नल तीव्रता में महत्वपूर्ण अंतर थे, लेकिन ACE2 द्वारा प्रतिशत बाध्यकारी अवरोध के माप में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था।

वर्तमान विधि और इस अध्ययन के लिए कई सीमाएं स्वीकार कर रहे हैं । सबसे पहले, विधि विकास और अनुकूलन में परीक्षण और उपयोग किए गए नमूनों को 8-11 नमूनों के सेट तक सीमित किया गया था। विधि को पूरी तरह से अनुकूलित करने के लिए विस्तारित अध्ययनों में अधिक नमूनों की जांच की जाएगी। दूसरा, रिपोर्टर फ्लोरोफोरस और रिपोर्टर जोड़ों की सीमित संख्या का परीक्षण किया गया । सभी संभव संयोजनों में सभी उपलब्ध संवाददाताओं का आगे परीक्षण यह निर्धारित करेगा कि इस विधि में कौन से अभिकर्षकों का सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। बायोटिन के लिए संजीदेबी एंटी-आईजीजी एंटीबॉडी बीवी ४२१ रिपोर्टर के साथ संजीदेबी से अलग था । इसलिए, हालांकि बीवी 421 एंटी-आईजीजी के लिए सिग्नल तीव्रता में परिवर्तनशीलता मौजूद थी, यह एंटीबॉडी की विशिष्टता के कारण हो सकता है और रिपोर्टर डाई से संबंधित नहीं हो सकता है। अन्य उपलब्ध बीवी 421-संयुग्मित एंटीबॉडी का परीक्षण करना एक अन्य एंटीबॉडी की पहचान कर सकता है जो आरपी2 चैनल में अच्छा प्रदर्शन करेगा। भविष्य के अध्ययन भी क्रमशः RP1 और RP2 में पता लगाने के लिए बीवी ४२१ एंटी ह्यूमन आईजीजी के साथ पीई एंटी-आईजीएम के संयोजन का मूल्यांकन करेंगे । पिछले, यहां तक कि साधन की दोहरी रिपोर्टर क्षमता के साथ, परख प्रतिक्रिया प्रति दो आइसोटाइप (दो पैरामीटर) तक सीमित हैं। यदि अतिरिक्त आइसोटाइप को मापा जाना है या पूर्ण आइसोटाइपिंग वांछित है, तो एक ही दो रिपोर्टर चैनलों का उपयोग करके अतिरिक्त प्रतिक्रियाओं को अलग कुओं में चलाने की आवश्यकता होगी ।

मनका आधारित मल्टीप्लेक्सिंग तकनीक नियमितप्रयोगशाला कार्यप्रवाह^3,4,10में आसान कार्यान्वयन के साथ तेजी से और लचीला परख डिजाइन के लिए अनुमति देता है। इस अध्ययन में पहले वर्णित 3Flex सीरोलॉजिकल और बेअसर परख सार्स के लिए एक एकल रिपोर्टर के साथ IgG मापने के लिए एक प्रवाह विश्लेषण प्रणाली पर पर, या मामूली संशोधन के साथ, एक साथ दोनों IgG और IgM प्रतिक्रियाओं को मापने में आसानी का प्रदर्शन दो संवाददाताओं का उपयोग कर । ड्यूल रिपोर्टर विकल्प एकल रिपोर्टर प्लेटफार्मों पर स्पष्ट लाभ है क्योंकि यह नमूना प्रति दो बार के रूप में अधिक डेटा प्रदान कर सकते हैं, आधे नमूना मात्रा का उपयोग कर, और प्रतिक्रिया कुओं की आधी संख्या में । उपयुक्त रिपोर्टर रंगों और पता लगाने एंटीबॉडी के साथ, आइसोटाइपिंग परख आसानी से विकसित किया जा सकता है और दोहरी रिपोर्टर प्रवाह विश्लेषण उपकरण पर प्रदर्शन किया जा सकता है।

Materials

ACE2 (human) (rec.)	AdipoGen Life Sciences	AG-40B-0192-3050
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-065-098
Bovine Serum Albumin	MilliporeSigma	A7888	Sigma-Aldrich
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator	Various
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3650
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile	Corning	6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-506-129	Discontinued but available from multiple vendors
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate	ThermoFisher Scientific	62-4317-82
Fisherbrand Incubating Microplate Shaker	ThermoFisher Scientific	02-217-757	Fisher Scientific
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE	ThermoFisher Scientific	P-2771MP
Luminex Magnetic Plate Separator	Luminex Corporation	CN-0269-01
MagPlex beads	Luminex Corporation	MC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-116-129
Phosphate Buffered Saline	MilliporeSigma	P3813	Sigma-Aldrich
SARS Nucleocapsid Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56683	Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Nucleocapsid Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56049	Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified
SARS Spike Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56047	Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Spike Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56048	Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb	SinoBiological	40150-R007
Sodium Azide	MilliporeSigma	S2002	Sigma-Aldrich
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)	ThermoFisher Scientific	S21388	premium grade
Tube Revolver/ Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
TWEEN 20	MilliporeSigma	P9416	Sigma-Aldrich
xMAP Antibody Couplng Kit	Luminex Corporation	40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SE	Luminex Corporation	INTELLIFLEX-DRSE-RUO