בדיקת נטרול מהירה, מולטיפלקס כפולה IgG ו- IgM SARS-CoV-2 עבור מערכת ניתוח זרימה מבוססת חרוזים מרובי קסים

Summary

מערכת ניתוח זרימה לבדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים המספקת קריאה של שני עיתונאים שימשה לפיתוח בדיקות נטרול סרולוגיות ונוגדנים מולטיפלקס שיכולות למדוד בו זמנית נוגדני IgG ו- IgM מנטרלים עבור SARS-CoV-2.

Abstract

מגפת COVID-19 הדגישה את הצורך בשיטות מהירות בעלות תפוקה גבוהה לגילוי סרולוגי רגיש וספציפי של זיהום עם פתוגנים חדשניים, כגון SARS-CoV-2. בדיקות סרולוגיות מולטיפלקס יכול להיות שימושי במיוחד כי זה יכול בו זמנית לנתח נוגדנים אנטיגנים מרובים כי מייעל כיסוי פתוגן, ובקרות על שונות באורגניזם ואת התגובה המארחת בודדים. כאן אנו מתארים בדיקה מבוססת מיקרוספרה SS-CoV-2 IgG 3-plex המבוססת על מיקרוספירה שיכולה לזהות הן נוגדני IgM והן IgG לשלושה אנטיגנים גדולים SARS-CoV-2 – ספייק (S), ספייק אנגיוטנסין-המרת אנזים-2 (ACE2) קולטן מחייב תחום (RBD), ונוקלאוקפסד (Nc). בדיקת ההוכחה יש ביצועים דומים לבדיקת ייחוס SARS-CoV-2 עבור IgG בסרום שהושג ב -≥21 ימים מתחילת הסימפטומים, אך הייתה רגישות גבוהה יותר עם דגימות שנאספו ב -≤5 ימים מתחילת הסימפטומים. יתר על כן, באמצעות ACE2 מסיס בפורמט בדיקה מנטרל, עיכוב של כריכת נוגדנים הודגם עבור S ו RBD.

Introduction

מגפת COVID-19 הדגישה את החשיבות של היכולת לפתח וליישם במהירות בדיקות סרולוגיות מהירות, בעלות תפוקה גבוהה ובעלות ביצועים גבוהים, שניתן להשתמש בהן לאבחון ומעקב אחר פתוגנים חדשניים כגון SARS-CoV-2. בדיקות סרולוגיות מולטיפלקס יכול להיות שימושי מאוד במגיפה, כפי שהוא יכול בו זמנית לנתח נוגדנים אנטיגנים מרובים, אשר מספק כיסוי פתוגן רחב ובקרות על שונות באורגניזם ואת התגובה המארחת לזיהום. הפיתוח של בדיקה מבוססת חרוזים פלואורסצנטית מולטיפלקס, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), שיכול לזהות נוגדנים לחלבון ספייק (S), האנזים הממיר אנגיוטנסין ספייק-2 (ACE2) קולטן מחייב תחום (RBD), ו nucleocapsid (Nc) של SARS-CoV-2 דווח לאחרונה¹. 3Flex הוכח שיש ביצועים דומים לבדיקת SARS-CoV-2 IgG ייחוס עבור סרום המתקבל ב -≥21 ימים מתחילת הסימפטומים, אך היה רגישות גבוהה יותר עם דגימות שנאספו ב -≤5 ימים מתחילת הסימפטומים. בנוסף, עיכוב של כריכת נוגדנים הודגם עבור אנטיגנים S ו- RBD באמצעות ACE2 מסיס במתכונת של נטרול. טכנולוגיה מבוססת חרוזים מולטיפלקס אומצה באופן נרחב כטכנולוגיה מוכחת לבדיקות סרולוגיות מולטיפלקס ויש לה יתרונות ברורים עבור הקרנה בקנה מידה גדול, כולל זמן קצר לתוצאות, דרישות מדגם קטן, ועבודה מופחתת^2,3,4.

לאחרונה, מכשיר ניתוח זרימה חדש הפך זמין המספק את אותה יכולת גבוהה plex, תפוקה גבוהה של המערכת הפגין בעבודה^{הקודמת 1}, אבל עם היתרון הנוסף של שני ערוצי עיתונאי. היכולת למדוד שני אותות כתב פלואורסצנטיים בתגובה אחת מאפשרת הערכה של שתי תוצאות לכל ניתוח עבור כל מדגם והיא אידיאלית עבור יישומי isotyping, אשר בדרך כלל חייב להתבצע בארות תגובה נפרדת⁵. יכולת הכתב הכפול מספקת נתונים כפולים עבור כל מדגם במחצית מבארות תגובה רבות עם מחצית מדרישות נפח המדגם, ולכן יש לה יתרון ברור על פני מערכות עיתונאיות בודדות. מחקר זה מפרט את פרוטוקול הבחינה הסרולוגית הסטנדרטית ומתאר את ההסתגלות לתפרור. בנוסף, דו”ח זה מתאר את ההמרה של כתב יחיד בבדיקה סרולוגית של כתב, ולאחר מכן, בדיקה כפולה של נטרול כתבים, כדי למדוד בו זמנית נוגדנים מנטרלים של איזוטיפים IgG ו- IgM נגד האנטיגנים SARS-CoV-2 S, RBD ו- Nc. סקירה חזותית של פרוטוקול ה-assay מסופקת באיור 1.

Protocol

שאריות דגימות סרום אנושי נבדקו בעבר עבור ניתוחי אבחון SARS-CoV-2 שימשו במחקר זה אשר אושר על ידי אוניברסיטת רוצ’סטר מוסדי סקירה. 1. ריאגנטים וציוד להשיג אנטיגנים קורונה ו- IgG אנושי ו- IgM ממקורות מסחריים. השג ערכות חרוזים של בקרת פיקוח (AC) (45 ו- 220) מספק המכשירים. חרוז AC להגדיר 45 צגים חציוני פלואורסצנטיות אינטנסיביות (MFI) אוסף על מכשירים ערוץ כתב יחיד (RP1). חרוז AC להגדיר 220 צגים אוסף MFI בערוץ הכתב השני (RP2). להשיג נוגדני זיהוי ו סרה ארנב ספציפי אנטיגן ונוגדנים המשמשים לאישור צימוד. בצע את הזיהוי עם נוגדנים עם תווית ביוטין עם סטרפטבידין, מצומד R-phycoerythrin (SAPE) או מצומד סטרפטאבידין של פלואורופור סופר בהיר 436 (SASB; עירור ב 405 ננומטר (nm) ופליטה ב 436 ננומטר). להשיג חלבון ACE2 אנושי (כלומר, קולטן הסארס). לפני השימוש, rehydrate חלבון ACE2 ליופילי על ידי המסה לריכוז 1 מ”ג / מ”ל במים ללא נוקלאז (לא DEPC מטופל, autoclaved ו 0.2-מיקרומטר סטרילי מסונן) ולאחסן ב 4 °C (4 °F). בצע את כל התגובות בלוחות שחורים שטוחים (NBS) בעלי משטחים שטוחים (NBS) בעלי 96 בארות. אוטמים את הלוחות עם 96 סרט איטום אלומיניום מיקרופלסטי היטב למדרגות הדגירה. השתמש במפריד צלחת מגנטית לשלבי שטיפת ההסמכה. 2. הכנת חרוזי בקרה מצמידי אנטיגן ונוגדנים זוגות כפולים מגנטיים, פוליסטירן וערכות מיקרוספירה מקודדות בצבע (קוטר 6.5 מיקרומטר) עם אנטיגנים S, RBD ו- Nc כמתואר קמרון ואח’1. אנטיגנים לקורונה מצמידים בשעה 22:00/106 חרוזים (S) ו-100 pmol/106 חרוזים (RBD ו-Nc). חרוזי בקרה בשילוב עם IgG אנושי או IgM נוצרים כפי שתואר בעבר1. IgG ו- IgM מצמידים ב 5 מיקרוגרם / 106 חרוזים. לאחר צימוד, לקבוע את ריכוזי החרוזים לדלל כל מניה ל 1 x 106 חרוזים / מ”ל באמצעות הליכים המתוארים6. בצע אישור של צימוד אנטיגן עם נוגדנים ספציפיים אנטיגן מארנב או עם סרה אנושית חיובית כמתואר קמרון ואח’1. אשרו צימוד IgG אנושי עם ריאגנטים לזיהוי IgG/SAPE אנטי-אנושיים של ה-Assay, ותיאום IgM עם IgM עזים אנטי-אנושיות עם תווית של פיטוריתרין (PE).הערה: אישור צימוד מתבצע באמצעות טיטציה של סרום או נוגדן ספציפיים לחלבון, כי הריכוז האופטימלי לשימוש עבור ריאגנטים אלה אינו ידוע. עבור סרום, דילול קיפול סדרתי משמשים ואילו עבור נוגדנים המסופקים כמו מאגרי mg / mL, סדרת דילול μg / mL סדרתי משמשים. לדלל את בקרת ה- Assay (AC) חרוזי מנטרים את אוסף ה- MFI בשני ערוצי הכתב לריכוז של 1 x 106 חרוזים/מ”ל לפני השימוש בתערובות חרוזים מולטיפלקס. 3. הכנת תערובת חרוזים מולטיפלקס טרי הכן חרוזי מולטיפלקס מתערבב טרי מדי יום מן החרוזים הזוגיים בודדים ואת מניות חרוזים שליטה ב 1 x 106 חרוזים / מ”ל.הערה: תערובות חרוזים מולטיפלקס מוכנות לספק 2,500 חרוזים עבור כל אזור חרוזים בנפח של 50 μL. חישובים כיצד להכין תערובות חרוז מולטיפלקס עבור כל מספר של תגובות מתוארים בבלוג שפורסם על ידי אנג’לוני (2020)6. 4. דילול דגימה הכן דילול דגימה בסרום 1:100 על ידי ערבוב 10 μL של סרום לתוך 990 μL של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 0.05% טווין 20, 0.02% נתרן אזיד, ו 1% של אלבומין סרום בקר (BSA) (חוצץ PBS-TBN). לדלל דגימות שוב פי 10 על ידי הוספת 20 μL של דילול 1:100 ל 180 μL של PBS-TBN.הערה: דגימות סרום מורכבות מסרה שלילית, מדגימות שנאספו בשנת 2019 לפני מגפת COVID-19, וסרה חיובית מחולים נשאי PCR SARS-CoV-2, המייצגים טיטרים נוגדנים נמוכים וגבוהים. דגימות חיוביות נאספו בין 3 ≈3 ל ->60 ימים מתחילת הסימפטומים (DFSO). כל דגימות הסרום וסרה שליטה שלילית מופשטת IgG מדוללים ל 1:1000 כמתואר להלן. לבדיקות נטרול, סרה מדוללת 1:500 כמתואר בפרוטוקולי הנטרול שלהלן (סעיפים 6 ו-8). 5. כתב יחיד סרולוגי בדיקות פרוטוקול הוסף 50 μL של תערובת חרוזים מולטיפלקס לכל באר שהוקצתה של צלחת microtiter 96-טוב לא מחייב. Pipette 50 μL של סרום 1:1000 או PBS-TBN לתוך בארות המתאימות; הדילול הסופי של הנסיוב בבאר הוא 1: 2000. מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטית ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות עם רועד ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי למשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה כמתואר להלן (הראשון לאחר מדגם דגירה לשטוף). הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ומנערים ב 37 °C במשך 2 דקות ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מגנט הצלחת במשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה כמתואר להלן (לשטוף דגירה לאחר מדגם שני). הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ומנערים ב 37 °C במשך 2 דקות ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מגנט הצלחת במשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. הסר את הצלחת מהמגנט. הכינו תערובת טרייה של IgG ביוטין-אנטי-אנושי עם SAPE על ידי דילול הנוגדן ל-0.62 מיקרוגרם/מ”ל וה-SAPE ל-1 מיקרוגרם/מ”ל. הוסף 100 μL לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטית ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות עם רועד ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי למשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה כמתואר להלן (הראשון לאחר גילוי נוגדן שטיפה). הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ומנערים ב 37 °C במשך 2 דקות ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מגנט הצלחת במשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה כמתואר להלן (השני לאחר גילוי דגירה נוגדן לשטוף). הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ומנערים ב 37 °C במשך 2 דקות ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי במשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. הסר את הצלחת מהמגנט. הוסף 100 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים עם חותם נייר כסף ומנערים במשך 2 דקות ב 37 °C (50 °F). מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת. לאחר מכן להסיר את חותם רדיד הכסף ולקרוא 50 μL של כל באר על מנתח הזרימה על פי מדריך למשתמש. תיאור קצר מסופק להלן. בחר את התפריט הנפתח בפינה הימנית העליונה של המסך ונווט אל תצורת לוחית. בחר לוח הפעלה. בחר בסמל הוצאת כדי להוציא את מנשא הלוח. טען את הצלחת על נושא הלוח ובחר את סמל ה-Retract כדי לבטל את מנשא הלוח. בחר בסמל הפעל כדי להפעיל את הצלחת. 6. פרוטוקול תיעקול נטרול כתב יחיד הכן תערובת חרוזים מולטיפלקס טרי כמתואר בסעיף 3 לעיל. לדלל חולה ולשלוט סרה 1: 500 כדלקמן. לדלל סרום 1:100 על ידי ערבוב 10 μL של סרום לתוך 990 μL של PBS-TBN. לדלל סרום פי 5 נוספים על ידי הוספת 40 μL של סרום 1:100 לתוך 160 μL של PBS-TBN. הוסף 50 μL של תערובת חרוזים מולטיפלקס לכל באר שהוקצתה של צלחת microtiter 96-טוב לא מחייב. הוסף 25 μL של 2 מיקרוגרם / mL דילול ACE2 לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטית ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 °C (37 °F) במשך 2 דקות עם רועד ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומסירים את אטם נייר הכסף. הוסף 25 μL של סרום 1:500 או PBS-TBN לבארות שהוקצו. מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטית ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות עם רועד ב 600 סל”ד. להמשך הליך ההסתה, בצע את שלבים 5.4 עד 5.18.5 כמתואר לעיל. 7. המרה לכתב כפול IgG ו- IgM סרולוגית הכן חרוזי אנטיגן מצמידים כמתואר בסעיף 2 לעיל.הערה: ערכת חרוזים נוספת, יחד עם IgM אנושי, כלולה כדי לפקח על תוספת של ריאגנטים לזיהוי נגד IgM, כמו גם ערכת חרוזים AC נוספת (220) כדי לפקח על איסוף של MFI עבור RP2. כל מניות החרוזים הן ב 1 x 106 חרוזים / מ”ל להכללה בתערובות חרוזים מולטיפלקס כמתואר להלן. הכן תערובות חרוז מולטיפלקס טריות כמתואר בסעיף 3 לעיל. לדלל דגימות סרום ו Sera שליטה שלילית IgG-הופשט 1:1000 כמתואר בסעיף 4 לעיל. הוסף 50 μL של תערובת חרוזים מולטיפלקס לכל באר שהוקצתה של צלחת microtiter 96-טוב לא מחייב. פיפט 50 μL של סרום 1:1000 או PBS-TBN לבארות המתאימות. הדילול הסופי של הנסיוב בבאר הוא 1: 2000. מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטית ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות עם רועד ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי למשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה כמתואר להלן (הראשון לאחר מדגם דגירה לשטוף). הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ומנערים ב 37 °C במשך 2 דקות ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מגנט הצלחת במשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה שוב עם PBS-TBN (לשטוף דגירה לאחר מדגם שני), בדיוק כפי שתואר לעיל בשלבים 7.10.1-7.10.5. הסר את הצלחת מהמגנט. הפוך תערובת ריאגנט זיהוי טרי עם השילוב הנדרש של ריאגנטים ולהוסיף 50 μL או 100 μL לכל באר.הערה: זיהוי תערובות ריאגנט המכילות את IgG אנטי אנושי מצומד צבע כתב סגול מבריק 421 (BV; עירור ב 405 ננומטר ופליטה ב 421 ננומטר) שימשו ב 50 μL / באר בשל כמויות מגבילות של ריאגנטים מלאי זמין. כל תערובות ריאגנט זיהוי אחרים משמשים ב 100 μL / well. מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטית ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות עם רועד ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי למשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה כמתואר להלן עם PBS-TBN (לשטוף הראשון לאחר גילוי דגירה נוגדנים). הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ומנערים ב 37 °C במשך 2 דקות ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי למשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. תוך שמירה על הצלחת על המגנט, להסיר את חותם רדיד הכסף, בזהירות הפוך את הצלחת מעל מיכל פסולת, בעדינות להעיף את supernatant מתוך בארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה שוב עם PBS-TBN (לשטוף שני לאחר גילוי דגירה נוגדן), בדיוק כפי שתואר לעיל בשלבים 7.17.1-7.17.5. הסר את הצלחת מהמגנט. הוסף 100 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים עם חותם נייר כסף ומנערים במשך 2 דקות ב 37 °C (50 °F). מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת. לאחר מכן להסיר את חותם רדיד אלומיניום ולקרוא 50 μL של כל באר על מנתח הזרימה כמתואר לעיל בשלבים 5.18.1-5.18-5. 8. המרה לנטרול כתב כפול השתמש חרוזים מצמידים כמתואר בשלב 7.1 לעיל. הכן תערובת חרוז מולטיפלקס טרי כמתואר בשלב 7.2. דגימות סרום וסרה שליטה שלילית מופשטת IgG מדוללים 1:500 כדלקמן. הכן דילול 1:100 על ידי ערבוב 10 μL של סרום לתוך 990 μL של PBS-TBN. לדלל את 1:100 דגימות פי 5 נוספים על ידי הוספת 40 μL של דילול 1:100 ל 160 μL של PBS-TBN. הוסף 50 μL של תערובת חרוזים מולטיפלקס לכל באר שהוקצתה של צלחת microtiter 96-טוב לא מחייב. הוסף 25 μL של 2 מיקרוגרם / mL דילול ACE2 לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטית ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 °C (37 °F) במשך 2 דקות עם רועד ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומסירים את אטם נייר הכסף. הוסף 25 μL של סרום 1:500 או PBS-TBN לבארות שהוקצו. מכסים את הצלחת עם חותם רדיד אלומיניום ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות עם רועד ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי למשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. כשהצלחת נשמרת על המגנט, מוציאים את אטם נייר הכסף, הפוך בזהירות את הצלחת מעל מיכל פסולת, ומעיף בעדינות את הסופר-טבעי מהבארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה כמתואר להלן (הראשון לאחר שטיפה דגירה מדגם). הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ומנערים ב 37 °C במשך 2 דקות ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי למשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. כשהצלחת נשמרת על המגנט, מוציאים את אטם נייר הכסף, הפוך בזהירות את הצלחת מעל מיכל פסולת, ומעיף בעדינות את הסופר-טבעי מהבארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה שוב עם PBS-TBN (לשטוף דגירה לאחר מדגם שני), בדיוק כפי שתואר לעיל בשלבים 8.13.1-8.13.5. הסר את הצלחת מהמגנט. הפוך תערובת ריאגנט זיהוי טרי עם השילוב הנדרש של ריאגנטים ולהוסיף 50 μL או 100 μL לכל באר.הערה: זיהוי תערובות ריאגנט המכילות את IgG אנטי אנושי הצומד לצבע כתב BV שימשו ב 50 μL / well בשל כמויות מגבילות של ריאגנטים מלאי זמין (ראה טבלה של חומרים). כל תערובות ריאגנט זיהוי אחרים משמשים ב 100 μL / well. מכסים את הצלחת עם חותם רדיד מיקרופלסטית ודגרה על שייקר צלחת מחומם ב 37 °C (55 °F) במשך 15 דקות עם רועד ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי למשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. כשהצלחת נשמרת על המגנט, מוציאים את אטם נייר הכסף, הפוך בזהירות את הצלחת מעל מיכל פסולת, ומעיף בעדינות את הסופר-טבעי מהבארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה כמתואר להלן (הראשון היה לאחר גילוי דגירה נוגדנים). הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ומנערים ב 37 °C במשך 2 דקות ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי למשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. כשהצלחת נשמרת על המגנט, מוציאים את אטם נייר הכסף, הפוך בזהירות את הצלחת מעל מיכל פסולת, ומעיף בעדינות את הסופר-טבעי מהבארות. כתם את הצלחת על נייר סופג תוך החזקת הצלחת על המגנט. לשטוף את בארות התגובה שוב עם PBS-TBN (לשטוף שני לאחר גילוי דגירה נוגדנים), בדיוק כפי שמפורט לעיל בשלבים 8.21.1-8.21.5. הסר את הצלחת ממגנט הצלחת ולהוסיף 150 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים את הצלחת עם חותם נייר כסף טרי ומנערים ב 37 °C במשך 2 דקות ב 600 סל”ד. מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת ומניחים על מפריד הלוח המגנטי במשך 2 דקות כדי להפריד את החרוזים מתערובת התגובה. כשהצלחת נשמרת על המגנט, מוציאים את אטם נייר הכסף, הפוך בזהירות את הצלחת מעל מיכל פסולת, ומעיף בעדינות את הסופר-טבעי מהבארות. הסר את הצלחת מהמגנט. הוסף 100 μL של PBS-TBN לכל באר. מכסים עם חותם נייר כסף ומנערים במשך 2 דקות ב 37 °C (50 °F). מוציאים את הצלחת משייקר הצלחת. לאחר מכן להסיר את חותם רדיד אלומיניום ולקרוא 50 μL של כל באר על מנתח הזרימה כמתואר לעיל בשלבים 5.18.1-5.18-5.

Representative Results

אופטימיזציה של הכתב היחיד סרולוגי.אסטרטגיית הצימוד של כל האנטיגנים SARS-CoV-2 מתוארת בקמרון, ואח ‘, 20201 ובצעד 2.1 לעיל. האסטרטגיה לאישור צימוד מתוארת בשלב 2.3 לעיל. עבור צימוד יעיל, ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות החציונית (MFI) צריכים להיות גבוהים משמעותית מאשר תגובות השליטה השליליות ללא סרום/ ללא נוגדנים, וצריכים להדגים תגובת מינון של אות MFI יורד עם כמויות פוחתות של ריאגנט זיהוי. MFIs של כ-1,000 יחידות MFI ומעלה על רקע MFI מצביעים בדרך כלל על צימוד חלבונים יעיל ותלויים בריכוז וספציפיות של ריאגנט הזיהוי בו נעשה שימוש. בשיטה זו נבדקו אישור של צימוד אנטיגן S, RBD ו-Nc עבור שני חרוזים רבים (איור 2). אותות MFI עבור כל האנטיגנים היו גבוהים באופן משמעותי מאשר MFI הרקע והראה תגובת מינון עם titration של ריאגנטים גילוי. הנתונים הראו גם שחזור טוב של רמות MFI בין שני סוגים שונים של חרוזים מצמידים. אופטימיזציה של אסייס כתב יחיד נעשה כמתואר קמרון, ואח ‘, 20201. כל אנטיגן נבדק בריכוזים שונים של צימוד עם דילול שונה של מספר דגימות סרום המייצגות דגימות גבוהות, בינוניות, נמוכות ושליליות. בנוסף, מכיוון שההתחבולה מודדת טיטרים של IgG, סרום מופשט IgG שימש כדגימה שלילית נוספת. תוצאות של סדרת דילול מדגם מייצגת עם רמות צימוד אנטיגן שונות מוצגות באיור 3. סדרת דילול ראשונית זו נבדקה עם ריכוז קבוע של ריאגנטים לזיהוי כדי לקבל מגוון פוטנציאלי של רמות MFI ספציפיות לאנטיגן ורקע. מנתונים אלה נקבעו ונבדקו טווחי דילול מדגם נוספים ורמות צימוד אנטיגן עם דגימות נוספות (הנתונים לא הוצגו). לאחר מכן, הריכוז של ריאגנט הזיהוי היה מותאם לשימוש עם דילול סרום שונים ורמות צימוד אנטיגן. נתונים מייצגים המשתמשים ב-6 דגימות חיוביות ו-2 דגימות שליליות מוצגים באיור 4. לאחר בדיקות נוספות עם כמה מאות דגימות שליליות לפני COVID-19 בסרום, נבחרו רמות צימוד האנטיגן האופטימליות הסופיות וריכוז העוצר לזיהוי לפרוטוקול הבדיקה הסופי, כמתואר בסעיף 5. המרה לתנטרל כתב יחידההמרה של הכתב היחיד סרולוגי בדיקות כדי בדיקת נטרול הושגה על ידי הוספת שלב דגירה באמצעות ACE2 (כמו ריאגנט מתחרה) עם החרוזים לפני הוספת דגימת הסרום. על ידי טיטרציה של כמות ACE2 הוסיף, עיכוב של איגוד IgG אנטיגנים S ו RBD נצפתה, כפי שמוצג באיור 5. בעוד סרה 11 החולה היו titers שונים של IgG, כל אחד הראה ירידה משמעותית אות MFI עם הגדלת ריכוז ACE2. כצפוי, ACE2 משפיע רק על אותות ה- MFI של S ו- RBD, אך לא על האנטיגן Nc. אות ה- MFI השיורי באחוזים ביחס ל- 0 מיקרוגרם/ מ”ל ACE2 עבור כל הדגימות מוצג באיור 6. עבור רוב הדגימות, אובדן אות >30% נצפתה עבור S ו RBD עם ריכוז ACE2 גובר. כצפוי, לא הייתה השפעה של ACE2 על אות Nc. המרה לכתב כפול IgG ובחטיפת סרולוגית IgMעבור הכתב הכפול IgG ו- IgM assay, תנאי הבדיקה הסטנדרטיים של כתב יחיד שימשו לבדיקת שילובי נוגדנים וכתבים שונים עבור שני ערוצי הכתבים. ערוץ RP1 דומה למכשירי ניתוח זרימה קודמים עם זיהוי פלואורסצנטיות “כתומה” עבור צבעי כתב כגון PE. הערוץ השני, RP2, משתמש בלייזר עירור סגול שיכול לשמש לזיהוי פלואורסצנטיות “כחולה” של צבעים נרגשים ב 402 ננומטר עם פסגות ספקטרום פליטה בטווח 421-441 ננומטר. מספר שילובים שונים של נוגדני IgG ו- IgM אנטי-אנושיים נבדקו בריכוזים שונים עם תנאי דילול הדגירה ודגרת הדגירה הסטנדרטיים של הדגימה פי 2,000 המפורטים בסעיף 6. בדיקה ראשונית של אנטי-IgM מצומדת לצבע הכתב DyLight 405 (DL 405; עירור ב-400 ננומטר ופליטה ב-420 ננומטר) עבור ערוץ RP2 בוצעה באמצעות קבוצה של 11 דגימות חיוביות PCR עם DFSO הנעות בין 5 ל->60 יום, ודגימת סרום מופשטת IgG. ריאגנט זיהוי זה לא הניב אות גבוה בערוץ RP2 כפי שמוצג באיור 7A,B,C. עבור דגימות עם MFI IgM RP2 גבוה, האותות הגבוהים ביותר נראו עבור RBD ו Nc (איור 7B,C). בעוד titers IgM צריך להיות מוגבה בשלב זה בדגימות מסוימות, רמות MFI שנצפו לא יעלה על 140 יחידות MFI עם ריאגנט זיהוי IgM. יתר על כן, חרוז השליטה עבור IgM חסר טווח דינמי משמעותי עבור MFI בעת שימוש DL 405 מצומד נגד IgM לעומת כתב RP1 תווית PE בשימוש באותם ריכוזים (איור 7D). מכיוון שמגיב זיהוי RP2 מתאים עם תווית כתב עבור IgM לא היה זמין, הביוטין המקורי נגד IgG עם SASB נבדק לשימוש בערוץ RP2. האות עבור IgG בערוץ RP2 עם SASB לא היה באותו טווח דינמי כמו עם SAPE, אבל עדיין היה לו טווח מתאים למדידת titers IgG עבור S, RBD, ו Nc (איור 8). נתונים אלה הובילו לבדיקת שילובי ריאגנט שונים של זיהוי RP1 IgM ו- RP2 IgG, כמתואר להלן. המרה לנטרול כתב כפולבדיקת הסרולוגית הכפולה הוסבה לבחינת נטרול על ידי הוספת שלב דגירה עם ACE2 וחרוזים, לפני הוספת דגימת הנסיוב. סדרת דילול פי 2 של ACE2 החל מ-16 מיקרוגרם/מ”ל שימשה, ולאחר מכן נבדקה עם סטים של 11 דגימות וסרה מופשטת כמתואר לעיל. בנוסף, 3 שילובים שונים של RP1 IgM ו RP2 IgG זיהוי תערובות נוגדנים נבדקו על קבוצה של 11 דגימות ובקרות סרום הפשיט. השילובים הסופיים וריכוז ריאגנט שנקבעו להיות אופטימליים מפורטים בטבלה 1. עבור זיהוי IgG, הביוטין אנטי אנושי IgG / SASB המשמש בבדיקת הכתב היחיד המקורי נבדק יחד עם עוד אנטי IgG מצומד צבע כתב BV. בעוד שלצידוי BV היו אותות MFI גבוהים של RP2, עוצמת האות של MFI עבור Titer IgG השתנתה על פני טיטרים ACE2(איור 9A,C,E). שילוב הביוטין אנטי-אנושי IgG / SASB היה עקבי יותר אות MFI ירידה על פני titration ACE2 לעומת ההטיה BV, הדגמת תגובת מינון, אם כי רמות MFI היו נמוכות יותר. תנודות האות על ידי ה-BV מצומדות על פני ריכוזי ACE2 הפריעו גם בקביעת אחוזי העיכוב על ידי ACE2 בטווח של טיטרים IgG בהשוואה לשילוב הביוטין האנטי-אנושי IgG/SASB(איור 9B,D,F). דגימות עם אותות MFI נמוכים, כגון מדגם DFSO 3, אין titers גבוה מספיק כדי להעריך את הביצועים של ריאגנטים אלה או למדוד קיבולת נטרול IgG. לקביעת Titers IgM בערוץ RP1, PE-מצומד אנטי-IgM הושווה IgM אנטי אנושי הצומד צבע כתב DyLight 549 (DL 549; עירור ב 562 ננומטר ופליטה ב 576 ננומטר) בריכוזים המפורטים בטבלה 1. מבין שני ריאגנטים אלה, PE אנטי-IgM הציג MFIs גבוה יותר מאשר אלה שנוצרו על ידי DL 549 IgM אנטי אנושי עבור הדגימות שנבדקו (איור 9A,C,E). לחרוז הבקרה של IgM המודד את התוספת של ריאגנטים אלה היו MFIs ממוצעים שונים של ≈ 17,000 עבור PE אנטי-IgM ו 2,723 עבור ההסתה DL 549. אפילו עם הבדלים אלה, ההשפעה של ריכוזי ACE2 השונים על MFI היה מדיד עם מצומד DL 549. לקביעת עיכוב ACE2 אחוזים של כריכת IgM, היה הבדל קל אך חסר משמעות בין שני ריאגנטים לזיהוי IgM(איור 9B,D, F). שילוב כתב ריכוז סופי בבאר (מיקרוגרם/מ”ל) RP1 RP2 1 PE אנטי-IgM 2 – ביוטין-י”ג – 0.62 SASB – 4 2 DyLight 549 IgM אנטי-אנושי 1 – מבריק סגול 421 אנטי אנושי IgG – 1 3 DyLight 549 IgM אנטי-אנושי 1 – ביוטין-י”ג – 0.62 SASB – 4 טבלה 1: רשימה של שילובי צבע כתב RP1 ו- RP2 שנבדקו. מספר צבעי כתבים שונים של RP1 ו- RP2 הוערכו למדידת טיטרים IgG ו- IgM. שלושת השילובים המוצגים לעיל נבדקו במצבי זיהוי שונים של RP1 ולאופטימיזציה של בדיקת הנטרול. עבור שילובי RP2 באמצעות SASB, מוצגים ריכוזים לנוגדן לזיהוי ביוטיניל ו- SASB. *הריכוז הסופי מייצג את הריכוז הסופי בתגובה היטב. איור 1: תרשים זרימה המדגיש את שלבי פרוטוקול ההסתה העיקריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: אישור על צימוד אנטיגן. אנטיגנים היו מצמידים ב 100, 10 ו 1 pmol / 106 חרוזים. עבור אנטיגנים S ו- RBD, ארנב אנטי Sera שימש וזיהה עם IgG אנטי ארנב PE. עבור Nc, חלבון G מטוהר ארנב אנטי Nc שימש. עקומות טיטור עבור חרוזים בשילוב עם 10 pmol S (A),100 pmol RBD(B),ו 100 pmol Nc (C) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: אופטימיזציה של דילול בסרום ברמות צימוד אנטיגן שונות. דגימות סרום המייצגות דגימות גבוהות, בינוניות, נמוכות ושליליות נבדקו עם צימודי החרוזים השונים של pmol antigen/106. טיטריון בסרום פי 4 נבדק עם תערובת מולטיפלקס של חרוזים מצמידי אנטיגן באמצעות פרוטוקול בדיקת ה-assay המתואר בסעיף 5. ערכי ה- MFI של עקומות התיוג עבור S (A), RBD (B)ו- Nc (C) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: קביעת דילול וסרום אופטימלי וריכוז ריאגנט לזיהוי. שמונה דגימות בסרום, כולל חולים שליליים (2 דגימות) וחיוביות נמוכה עד גבוהה (6 דגימות), נבדקו בדילול סרום נוסף עם שלושה ריכוזי ריאגנט גילוי שונים. תוצאות ה- MFI מוצגות עבור S (A), RBD (B)ו- Nc (C). בהתבסס על נתונים אלה ואחרים (לא מוצגים), דילול מדגם של 1:2,000 וריכוז נוגדנים לזיהוי ביוטין של 0.62 מיקרוגרם / מ”ל נבחר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: אופטימיזציה של תיעלית תיעמול עיתונאי יחיד. שינוי של הכתב היחיד סרולוגי בדיקות כדי מנטרל נוגדנים גילוי אסאי בוצע על ידי הוספת שלב דגירה עם ACE2 כמתחרה, כפי שתואר בסעיף 6. קבוצה של 11 דגימות, החל מ-titer sera נמוך עד גבוה-חיובי, ודגימת סרום פסים IgG נבדקו עם סדרת דילול כפולה של ACE2 החל מ 4 מיקרוגרם / mL, באמצעות תנאי בדיקה סטנדרטיים. על פני טווח זה של ריכוזי ACE2, ניתן לראות ירידה ב- MFI עם ACE2 מוגבר עבור S (A) ו- RBD (B), אך לא עבור Nc (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: אחוז עיכוב של האות עם ACE2. אחוז האותות השיוריים עבור קבוצה של 11 דגימות (מאיור 4) מוצגים. עבור כל מדגם, ללא קשר titer IgG שלה, ירידה מקסימלית של אות MFI ≥30% הושג עבור S (A) ו RBD (B) בריכוז ACE2 הגבוה ביותר. עבור אנטיגן Nc (C) לא היה עיכוב משמעותי של אות עם כל כמות של ACE2 נבדק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: בדיקה של DyLight 405 נגד IgM כ-RP2 זיהוי ריאגנט. קבוצה של 11 דגימות וסרה מופשטת IgG שימשו לבדיקת DL 405-מצומד נגד IgM כמו ריאגנט זיהוי RP2. אותות ה- MFI של RP2 IgM עבור S (A), RBD (B)ו- Nc (C) מוצגים. אות ה- MFI הגבוה ביותר עבור כל אנטיגן עם כל מדגם היה כ 140 יחידות MFI עבור RBD עם מדגם H (B). אפילו האות על ערכת חרוזי הבקרה של IgM היה פחות מ-1,000 MFI בערוץ RP2 בכל טווח הנוגדנים ולא הראה את הטווח הדינמי המוגבר שנצפו בנוגדן זיהוי אנטי-IgM PE בערוץ RP1(D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: אופטימיזציה של SASB ככתב RP2 עם ביוטין אנטי-IgG. קבוצה של 11 דגימות וסרה מופשטת IgG שימשו לבדיקת סדרת דילול של SASB עם תקן 0.62 מיקרוגרם / mL ביוטין אנטי IgG. MFIs IgG המתקבלים בערוץ RP2 עבור S (A), RBD (B) ו- Nc (C) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 9: השוואה בין שלושה שילובים שונים של תערובות זיהוי RP1 IgM ו-RP1 IgG. שלושה תערובות נוגדנים שונות לגילוי נבדקו על 11 דגימות ו- IgG הפשיט סרה. השילובים והריכוזים הסופיים המשמשים מתוארים בטבלה 1. כל הדגימות נבדקו עם דילול ACE2 פי 2, החל מ-16 מיקרוגרם/מ”ל. נתונים עבור דגימות ב- DFSO של 3, 12 ו- 30 יום מוצגים. אותות ה- MFI עבור RP1 IgM (כתום) ו- RP2 IgG (כחול) מוצגים ב- A (DFSO 3), C (DFSO 12) ו- E (DFSO 30). ה- MFIs שיורית של ACE2 אחוזים מוצגים ב- B (DFSO 3), D (DFSO 12) ו- F (DFSO 30). אותות המייצגים ירידה של >30% בהשוואה לבקרות No ACE2 מסומנים בירוק בהיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מחקר זה הרחיב את הפונקציונליות של בדיקת מיקרוספרה פלואורסצנטית מולטיפלקס, 3Flex, כי איכות מעריך את תגובת IgG לזיהום על ידי SARS-CoV-2¹. בעוד בדיקות סרולוגיות רבות עבור COVID-19 לזהות אנטיגן יחיד, הבדיקה הזו בו זמנית מעריכה אנטיגנים S, RBD ו- Nc, וכוללת בקרת איזוטיפ נוגדנים פנימית⁷. בנוסף, ACE2 משמש אינדיקטור לזיהוי טיטרים נוגדנים מנטרלים ל SARS-CoV-2.

בדיקות אנטיגנים מרובות עשויות להיות שימושיות במיוחד בעתיד להפלות תגובות חיסוניות בין אנשים נגועים לחיסון. עם SARS-CoV-2, אם רק נוגדני S ו- RBD מוערכים, לא ניתן יהיה להבחין אם זה היה בגלל זיהום בעבר או לתגובת נוגדנים חיסונית. אף אחד מהחיסונים הנמצאים כעת בשימוש לא מתמקד באנטיגן Nc, ולכן על ידי הערכת אנטיגנים S/RBD ו- Nc, ניתן להבחין בין זיהום ויראלי בעבר (Nc – ו- S / RBD-חיובי) מתגובת חיסון (S / RBD חיובי בלבד; NC שלילי).

במחקר הנוכחי הועברו 3 הבדיקות הסרולוגיות והמנטרלות של 3Flex (סעיפים 5 ו-6) למכשיר ניתוח זרימה דו-ספרתי חדש (סעיפים 7 ו-8). פרוטוקולי אימונואסה אופייניים לבדיקות מולטיפלקס מבוססות חרוזים דומים לפרוטוקולי ELISA סטנדרטיים, בעקבות שלבים דומים לדגירה מדגם, גילוי נוגדנים / דגירה של כתבים וניתוח תוצאות⁸. מחקרים קודמים הדגימו גם כיצד ניתן להעביר בדיקות ELISA סטנדרטיות לפלטפורמת מולטיפלקסינג מבוססת חרוזים⁹.

ניתן היה להעביר את פרוטוקולי הבדיקה בצורה חלקה ממכשיר הכתב הבודד שקדם לו למערכת הכתבים הכפולים החדשה, כפי שניתן לראות מהתוצאות שהושגו עבור דגימות הבדיקה והפקדים(איור 4 ואיור 5). ב-serological assay, כל דגימות הסרום החיוביות הדגימו ירידה אופיינית במינון-תגובה לאות המקביל הן לדילול מדגם גבוה יותר והן לריכוז נוגדנים בזיהוי נמוך יותר, בעוד האותות לדגימות השליליות נותרו ברמות הרקע. באופן דומה, עבור בדיקת נטרול, הפחתת אותות עבור S ו RBD, אבל לא Nc, התאים ריכוזים גוברים של המתחרה ACE2, בעוד סרום IgG הופשט הושפע הרבה פחות על ידי תוספת של ACE2. לפני הדגירה של החרוזים עם ACE2 במשך 2 דקות לפני הוספת דגימת הסרום (כמתואר בסעיפים 6 ו -8), הושוותה גם לשילוב החרוזים עם ACE2 וסרום בו זמנית והפיקה הבדל קטן בתוצאות (נתונים שלא הוצגו). עם זאת, מכיוון שהתוצאות שהושגו עם החרוזים בתוספת שלב טרום הדגירה של ACE2 היו עקביות יותר, היה זה ההליך הסופי שאומץ לפרוטוקול ההסתגרות לנטרול (סעיפים 6 ו-8).

מכיוון שמערכת הכתבים הכפולה משלבת ערוץ עיתונאי פלואורסצנטי שני, שתי ההבחנות הוסבו לתגובת איסוטיפינג כדי למדוד בו זמנית גם את תגובות IgG וגם את ה-IgM. הפונקציונליות הכפולה של מנתח הזרימה מאפשרת איסוף אותות פלואורסצנטיים משני ריאגנטים לזיהוי כתבים עבור כל ניתוח במולטיפלקס עבור כל מדגם, ולמעשה מכפילה את הנתונים הנוצרים לכל דגימה בבדיקה. לצורך פיתוח ואופטימיזציה של פרוטוקולי ה-assay של הכתבים הכפולים, נבדקו מספר צבעי כתבים ונוגדני זיהוי זמינים מסחרית עבור ערוץ RP2 החדש (איור 7 ואיור 8) כדי לקבוע את האפשרויות הטובות ביותר הזמינות. נוגדן האנטי-IgM שהורכב עם צבע הכתב DL 405 לא הצליח בערוץ RP2 (איור 7),כך שביוטין אנטי-IgG עם SASB הוערך לאחר מכן לגילוי בערוץ RP2 (איור 8). שלושה שילובים של ריאגנטים לזיהוי RP1 ו-RP2 הושוו בבחנת נטרול הכתבים הכפולה (טבלה 1 ואיור 9) כדי לקבוע את השילובים בעלי הביצועים הטובים ביותר לזיהוי סימולטני נוגדנים מנטרלים של IgG ו-IgM. אמנם היו הבדלים משמעותיים בעוצמת האות בין ערוץ RP1 באמצעות PE-anti IgM לבין ערוץ RP2 באמצעות DL 549 אנטי-IgM, לא היה הבדל משמעותי במדידת עיכוב הכריכה אחוז על ידי ACE2.

מספר מגבלות לשיטה הנוכחית ומחקר זה מוכרים. ראשית, הדגימות שנבדקו ושימשו בפיתוח השיטה ואופטימיזציה הוגבלו ערכות של 8-11 דגימות. דגימות נוספות ייבדקו במחקרים מורחבים כדי לוודא שהשיטה ממוטבת במלואה. שנית, מספר מוגבל של פלואורופורים עיתונאים וזוגות עיתונאים נבדקו. בדיקה נוספת של כל הכתבים הזמינים בכל השילובים האפשריים תקבע אילו ריאגנטים ניתן להשתמש בהצלחה בשיטה זו. נוגדן האנטי-IgG שהוכנס לביוטין היה שונה מהנוגדן האנטי-IgG שהוכנס לכתב BV 421. אז, למרות השונות בעוצמת האות עבור BV 421 אנטי IgG קיים, זה יכול להיות בגלל הספציפיות של הנוגדן ולא קשור צבע הכתב. בדיקת נוגדנים זמינים אחרים BV 421-מצומד עשוי לזהות נוגדן אחר שיתפקד היטב בערוץ RP2. מחקרים עתידיים גם להעריך את השילוב של PE אנטי IgM עם BV 421 אנטי אנושי IgG לגילוי RP1 ו RP2, בהתאמה. לבסוף, אפילו עם יכולת הכתב הכפולה של המכשיר, ההסתה מוגבלת לשני איזוטיפים (שני פרמטרים) לכל תגובה. אם יש למדוד איזוטיפים נוספים או רצוי איזוטיפינג מלא, אז תגובות נוספות באמצעות אותם שני ערוצי כתב יצטרכו להיות מנוהלות בבארות נפרדות.

טכנולוגיית מולטיפלקסינג מבוססת חרוזים מאפשרת תכנון מהיר וגמיש של בדיקות עם יישום קל לזרימות עבודה שגרתיות במעבדה^3,4,10. מחקר זה הדגים את הקלות בהעברת הבדיקות הסרולוגיות והנטרלות של 3Flex שתוארו בעבר עבור SARS-CoV-2 למערכת ניתוח זרימה למדידת IgG עם כתב אחד, או עם שינוי קל, בו זמנית מדידת תגובות IgG ו- IgM באמצעות שני כתבים. לאפשרות הכתב הכפול יש יתרונות ברורים על פני פלטפורמות עיתונאיות בודדות מכיוון שהיא יכולה לספק כמות כפולה של נתונים לדגימה, תוך שימוש במחצית מנפח המדגם, ובמחצית ממספר בארות התגובה. עם צבעי הכתב המתאימים ונוגדני זיהוי, ניתן לפתח בקלות את הבדיקות האיזוטיפיות על מכשיר ניתוח זרימת הכתב הכפול.

Materials

ACE2 (human) (rec.)	AdipoGen Life Sciences	AG-40B-0192-3050
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-065-098
Bovine Serum Albumin	MilliporeSigma	A7888	Sigma-Aldrich
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator	Various
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch Laboratories	709-675-149
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate	Corning	3650
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile	Corning	6570
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-475-043
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-506-129	Discontinued but available from multiple vendors
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate	ThermoFisher Scientific	62-4317-82
Fisherbrand Incubating Microplate Shaker	ThermoFisher Scientific	02-217-757	Fisher Scientific
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE	ThermoFisher Scientific	P-2771MP
Luminex Magnetic Plate Separator	Luminex Corporation	CN-0269-01
MagPlex beads	Luminex Corporation	MC100XX-ID
PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific	Jackson ImmunoResearch Laboratories	109-116-129
Phosphate Buffered Saline	MilliporeSigma	P3813	Sigma-Aldrich
SARS Nucleocapsid Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56683	Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Nucleocapsid Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56049	Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified
SARS Spike Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56047	Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS Spike Protein Antibody	Novos Biologicals	NB100-56048	Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb	SinoBiological	40150-R007
Sodium Azide	MilliporeSigma	S2002	Sigma-Aldrich
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE)	ThermoFisher Scientific	S21388	premium grade
Tube Revolver/ Rotator	ThermoFisher Scientific	88881001
TWEEN 20	MilliporeSigma	P9416	Sigma-Aldrich
xMAP Antibody Couplng Kit	Luminex Corporation	40-50016
xMAP INTELLIFLEX DR-SE	Luminex Corporation	INTELLIFLEX-DRSE-RUO