Ett flödesanalyssystem för pärlbaserade multiplexerade analyser som ger en avläsning av två reporter användes för utveckling av multiplex serologiska och antikroppsneutraliseringsanalyser som samtidigt kan mäta neutraliserande IgG- och IgM-antikroppar för SARS-CoV-2.
COVID-19-pandemin har understrukit behovet av snabba metoder för hög genomströmning för känslig och specifik serologisk detektion av infektion med nya patogener, såsom SARS-CoV-2. Multiplex serologiska tester kan vara särskilt användbara eftersom det samtidigt kan analysera antikroppar mot flera antigener som optimerar patogentäckningen och kontroller för variabilitet i organismen och det enskilda värdsvaret. Här beskriver vi en SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerande mikrosfärbaserad analys som kan upptäcka både IgM- och IgG-antikroppar mot tre stora SARS-CoV-2-antigener-spike (S) proteinet, spike angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2) receptorbindande domän (RBD) och nukleocapsid (Nc). Analysen visade sig ha jämförbar prestanda med en SARS-CoV-2 referensanalys för IgG i serum som erhållits vid ≥21 dagar från symptominställning men hade högre känslighet med prover som samlats in vid ≤5 dagar från symptom inset. Vidare, med hjälp av lösliga ACE2 i ett neutraliseringsanalysformat, visades hämning av antikroppsbindning för S och RBD.
COVID-19-pandemin har betonat vikten av att snabbt kunna utveckla och implementera snabba, högpresterande, högpresterande serologiska tester som kan användas för diagnos och övervakning av nya patogener som SARS-CoV-2. Multiplex serologiska tester kan vara extremt användbara i en pandemi, eftersom det samtidigt kan analysera antikroppar mot flera antigener, vilket ger bred patogentäckning och kontroller för variabilitet i organismen och värdens svar på infektion. Utvecklingen av en multiplex fluorescerande pärlbaserad analys, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), som kan upptäcka antikroppar mot spike (S) proteinet, spik angiotensin-omvandla enzym-2 (ACE2) receptorbindande domän (RBD) och nukleocapsid (Nc) av SARS-CoV-2 rapporterades nyligen1. 3Flex visade sig ha jämförbar prestanda med en referens SARS-CoV-2 IgG-analys för serum som erhållits vid ≥21 dagar från symtomuppkomst men hade högre känslighet med prover som samlats in vid ≤5 dagar från symptominställning. Dessutom visades hämning av antikroppsbindning för S- och RBD-antigener med lösliga ACE2 i neutraliseringsanalysformat. Multiplex pärlbaserad teknik har antagits allmänt som en beprövad teknik för multiplex serologisk testning och har tydliga fördelar för storskalig screening, inklusive korta tid-till-resultat, små urvalskrav och minskad arbetskraft2,3,4.
Nyligen har ett nytt flödesanalysinstrument blivit tillgängligt som ger samma högplex, hög genomströmningskapacitet i systemet som demonstrerades i tidigare arbete1, men med den extra fördelen av två reporterkanaler. Förmågan att mäta två fluorescerande reportersignaler i en enda reaktion gör det möjligt att bedöma två resultat per analyt för varje prov och är idealisk för isotypningstillämpningar, som vanligtvis måste utföras i separata reaktionsbrunnar5. Den dubbla reporterkapaciteten ger dubbelt så mycket data för varje prov i hälften så många reaktionsbrunnar med hälften av provvolymkraven och har därmed en klar fördel jämfört med system med enstaka reporter. Denna studie beskriver standard serologiska analys protokollet och beskriver anpassningen till en neutralisering analys. Dessutom beskriver denna rapport omvandlingen av den enda reportern analys till en dubbel reporter serologiska analys, och därefter en dubbel reporter neutralisering analys, att samtidigt mäta neutraliserande antikroppar av både IgG och IgM isotyper mot SARS-CoV-2 S, RBD och Nc antigener. En visuell översikt över analysprotokollet finns i figur 1.
Denna studie utvidgade funktionaliteten hos en multiplex fluorescerande mikrosfäranalys, 3Flex, som kvalitativt bedömer IgG-svaret på infektion av SARS-CoV-21. Medan många serologiska analyser för COVID-19 upptäcker ett enda antigen, utvärderar denna analys samtidigt S-, RBD- och Nc-antigener och innehåller en intern antikroppsisotypkontroll7. Dessutom används ACE2 som en indikator för att upptäcka neutraliserande antikroppstitrar till SARS-CoV-2.
Multi-antigen analyser kan vara särskilt användbara i framtiden för att diskriminera immunsvar mellan smittade och vaccinerade personer. Med SARS-CoV-2, om endast S- och RBD-antikroppar utvärderas, skulle det vara omöjligt att urskilja om detta berodde på en tidigare infektion eller på ett vaccinationsantikroppssvar. Inget av de vacciner som för närvarande används är inriktat på Nc-antigenet, så genom att utvärdera S/RBD- och Nc-antigener är det möjligt att skilja tidigare virusinfektion (nc- och S/RBD-positiv) från ett vaccinationssvar (endast S/RBD-positivt; Nc-negativ).
I den aktuella studien överfördes 3Flex serologiska och neutraliseringsanalyser (avsnitten 5 och 6) till ett nytt instrument för dubbel reporterflödesanalys (avsnitten 7 och 8). Typiska immunoassay protokoll för pärla-baserade multiplex analyser liknar standard ELISA protokoll, efter jämförbara steg för prov inkubation, detektion antikropp/reporter inkubation och analys av resultat8. Tidigare studier har också visat hur vanliga ELISA-analyser kan överföras till en pärlbaserad multiplexplattform9.
Analysprotokollen skulle sömlöst kunna överföras från det tidigare instrumentet för en enda reporter till det nya systemet med dubbla reporterr, vilket framgår av de resultat som erhållits för proverna och kontrollerna(figur 4 och figur 5). I den serologiska analysen visade alla positiva serumprover en karakteristisk dosresponsiv minskning av signalen som motsvarade både en högre provutspädning och en lägre antikroppskoncentration, medan signalerna för de negativa proverna låg kvar på bakgrundsnivåer. För neutraliseringsanalysen motsvarade också minskande signaler för S och RBD, men inte Nc, ökande koncentrationer av ACE2-konkurrenten, medan IgG-avskalat serum påverkades mycket mindre av tillsats av ACE2. Förinkubation av pärlor med ACE2 i 2 minuter före tillsats av serumprovet (enligt beskrivningen i avsnitten 6 och 8), jämfördes också med att kombinera pärlorna med ACE2 och serum samtidigt och gav liten skillnad i resultaten (data som inte visas). Eftersom de resultat som erhållits med pärlor plus ACE2 före inkubation steg var mer konsekvent, var det dock det slutliga förfarandet som antagits för neutraliseringsanalysprotokollet (avsnitten 6 och 8).
Eftersom det dubbla reportersystemet innehåller en andra fluorescerande reporterkanal omvandlades båda analyserna till isotypningsanalyser för att samtidigt mäta både IgG- och IgM-svar. Flödesanalysatorns dubbla reporterfunktionalitet gör det möjligt att samla in fluorescerande signaler från två reagenser för reporterdetektering för varje analyt i multiplexen för varje prov, vilket effektivt fördubblar de data som genereras per prov i en analys. För utveckling och optimering av de dubbla reporteranalysprotokollen utvärderades flera kommersiellt tillgängliga reporterfärger och detektionsantikroppar för den nya RP2-kanalen (figur 7 och figur 8) för att bestämma det bästa tillgängliga alternativet. Anti-IgM-antikroppen som konjugerades med DL 405-reporterfärgen presterade inte bra i RP2-kanalen (figur 7), så biotinanti-IgG med SASB utvärderades därefter för detektion i RP2-kanalen (figur 8). Tre kombinationer av reagenser för RP1- och RP2-detektion jämfördes i den dubbla reporterneutraliseringsanalysen(tabell 1 och figur 9) för att bestämma de bäst presterande kombinationerna för samtidig detektion av IgG- och IgM-neutraliserande antikroppar. Även om det fanns betydande skillnader i signalintensiteten mellan RP1-kanalen med PE-anti IgM och RP2-kanalen med DL 549 anti-IgM, fanns det ingen signifikant skillnad i mätningen av procentbindningshämningen av ACE2.
Flera begränsningar av den nuvarande metoden och denna studie bekräftas. För det första var de prover som testades och användes i metodutveckling och optimering begränsade till uppsättningar av 8-11 prover. Fler prover kommer att testas i utökade studier för att verifiera att metoden är helt optimerad. För det andra testades ett begränsat antal reporterfluoroforer och reporterpar. Ytterligare testning av alla tillgängliga reportrar i alla möjliga kombinationer kommer att avgöra vilka reagenser som kan användas framgångsrikt i den här metoden. Anti-IgG antikropp konjugerade till biotin var annorlunda än anti-IgG antikroppar konjugerade till BV 421 reporter. Så även om variation i signalintensiteten för BV 421 anti-IgG fanns, kan det bero på antikroppens specificitet och inte relaterad till reporterfärgämnet. Testning av andra tillgängliga BV 421-konjugerade antikroppar kan identifiera en annan antikropp som skulle fungera bra i RP2-kanalen. Framtida studier kommer också att utvärdera kombinationen av PE anti-IgM med BV 421 anti-human IgG för detektion i RP1 respektive RP2. Sist, även med instrumentets dubbla reporterkapacitet, är analyser begränsade till två isotyper (två parametrar) per reaktion. Om ytterligare isotyper ska mätas eller fullständig isotypning önskas, måste ytterligare reaktioner med samma två reporterkanaler köras i separata brunnar.
Pärlbaserad multiplexeringsteknik möjliggör snabb och flexibel analysdesign med enkel implementering i rutinmässiga laboratoriearbetsflöden3,4,10. Denna studie visade hur lätt det är att överföra de tidigare beskrivna 3Flex serologiska och neutraliseringsanalyser för SARS-CoV-2 till ett flödesanalyssystem för att mäta IgG med en enda reporter, eller med liten modifiering, samtidigt som både IgG- och IgM-svar mäts med hjälp av två reportrar. Alternativet med dubbla reporter har tydliga fördelar jämfört med enskilda reporterplattformar eftersom det kan ge dubbelt så mycket data per prov, med hälften av provvolymen och i hälften av antalet reaktionsbrunnar. Med lämpliga reporterfärger och detektionsantikroppar kan isotypningsanalyser enkelt utvecklas och utföras på det dubbla reporterflödesanalysinstrumentet.
The authors have nothing to disclose.
Denna rapport finansierades av Luminex Corporation (Austin, TX). Författarna tackar Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) för vetenskaplig redigeringshjälp.
ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |