Et strømningsanalysesystem for perlebaserte multipleksede analyser som gir en to-reporter-avlesning ble brukt til utvikling av multipleks serologiske og antistoffnøytraliseringsanalyser som samtidig kan måle nøytraliserende IgG- og IgM-antistoffer for SARS-CoV-2.
COVID-19-pandemien har understreket behovet for raske høygjennomstrømningsmetoder for sensitiv og spesifikk serologisk deteksjon av infeksjon med nye patogener, for eksempel SARS-CoV-2. Multiplex serologisk testing kan være spesielt nyttig fordi den samtidig kan analysere antistoffer mot flere antigener som optimaliserer patogendekningen, og kontroller for variasjon i organismen og den enkelte vertsresponsen. Her beskriver vi en SARS-CoV-2 IgG 3-plex fluorescerende mikrosfærebasert analyse som kan oppdage både IgM- og IgG-antistoffer mot tre store SARS-CoV-2 antigener- spike (S) protein, spike angiotensin-konverterende enzym-2 (ACE2) reseptorbindingsdomene (RBD) og nukleocapsid (Nc). Analysen viste seg å ha sammenlignbar ytelse med en SARS-CoV-2 referanseanalyse for IgG i serum oppnådd ved ≥21 dager fra symptomde begynnelse, men hadde høyere følsomhet med prøver samlet inn ved ≤5 dager fra symptomde begynnelse. Videre, ved hjelp av løselig ACE2 i et nøytraliseringsanalyseformat, ble hemming av antistoffbinding demonstrert for S og RBD.
COVID-19-pandemien har understreket viktigheten av å raskt utvikle og implementere raske, høygjennomstrømningstester med høy ytelse som kan brukes til diagnostisering og overvåking av nye patogener som SARS-CoV-2. Multiplex serologisk testing kan være ekstremt nyttig i en pandemi, da den samtidig kan analysere antistoffer mot flere antigener, noe som gir bred patogendekning og kontroller for variasjon i organismen og vertsresponsen på infeksjon. Utviklingen av en multipleks fluorescerende perlebasert analyse, SARS-CoV-2 IgG 3Flex (3Flex), som kan oppdage antistoffer mot spike (S) proteinet, spike angiotensin-konverterende enzyme-2 (ACE2) reseptorbindingsdomene (RBD) og nukleocapsid (Nc) av SARS-CoV-2 ble nylig rapportert1. 3Flex ble vist å ha sammenlignbar ytelse med en referanse SARS-CoV-2 IgG-analyse for serum oppnådd ved ≥21 dager fra symptomde begynnelse, men hadde høyere følsomhet med prøver samlet inn ved ≤5 dager fra symptomde begynnelse. I tillegg ble hemming av antistoffbinding demonstrert for S- og RBD-antigener ved bruk av løselig ACE2 i et nøytraliseringsanalyseformat. Multiplex perlebasert teknologi har blitt allment tatt i bruk som en anerkjent teknologi for multiks serologisk testing og har klare fordeler for storskala screening, inkludert korte tid-til-resultater, små utvalgskrav og redusert arbeidskraft2,3,4.
Nylig har et nytt strømningsanalyseinstrument blitt tilgjengelig som gir samme høy-plex, høy gjennomstrømningsevne som systemet demonstrerte i tidligere arbeid1, men med den ekstra fordelen av to reporterkanaler. Evnen til å måle to fluorescerende reportersignaler i en enkelt reaksjon tillater vurdering av to resultater per analytt for hver prøve og er ideell for isotypingsapplikasjoner, som vanligvis må utføres i separate reaksjonsbrønner5. Den doble reporterkapasiteten gir dobbelt så mye data for hvert utvalg i halvparten så mange reaksjonsbrønner med halvparten av kravene til prøvevolum, og har dermed en klar fordel i forhold til enkeltreportersystemer. Denne studien beskriver standard serologisk analyseprotokoll og beskriver tilpasningen til en nøytraliseringsanalyse. I tillegg beskriver denne rapporten konverteringen av enkeltreporteranalysen til en dobbel reporter serologisk analyse, og deretter en dual reporter nøytraliseringsanalyse, for samtidig å måle nøytraliserende antistoffer av både IgG- og IgM-isotyper mot SARS-CoV-2 S, RBD og Nc antigener. Du finner en visuell oversikt over analyseprotokollen i figur 1.
Denne studien utvidet funksjonaliteten til en multipleks fluorescerende mikrosfæreanalyse, 3Flex, som kvalitativt vurderer IgG-responsen på infeksjon av SARS-CoV-21. Mens mange serologiske analyser for COVID-19 oppdager et enkelt antigen, evaluerer denne analysen samtidig S-, RBD- og Nc-antigener, og inkluderer en intern antistoffisotypekontroll7. I tillegg brukes ACE2 som en indikator for å oppdage nøytraliserende antistofftitratorer til SARS-CoV-2.
Multiantigenanalyser kan være spesielt nyttige i fremtiden for å diskriminere immunresponser mellom smittede og vaksinerte personer. Med SARS-CoV-2, hvis bare S- og RBD-antistoffer evalueres, ville det være umulig å skjelne om dette skyldtes en tidligere infeksjon eller en vaksinasjonsantistoffrespons. Ingen av vaksinene som for tiden er i bruk retter seg mot nc-antigenet, så ved å evaluere S/RBD- og Nc-antigener er det mulig å skille tidligere virusinfeksjon (nc- og S/RBD-positiv) fra en vaksinasjonsrespons (kun S/RBD-positiv; Nc-negativ).
I den nåværende studien ble 3Flex serologiske og nøytraliseringsanalyser (avsnitt 5 og 6) overført til et nytt dobbelt reporterstrømningsanalyseinstrument (avsnitt 7 og 8). Typiske immunoassayprotokoller for perlebaserte multipleksanalyser ligner på standard ELISA-protokoller, etter sammenlignbare trinn for prøveinkubasjon, deteksjonsantistoff/reporterinkubasjon og analyse av resultatene8. Tidligere studier har også vist hvordan standard ELISA-analyser kan overføres til en perlebasert multipleksingsplattform9.
Analyseprotokollene kan overføres sømløst fra forgjengerens enkeltreporterinstrument til det nye dobbeltreportersystemet, som vist i resultatene som er oppnådd for testprøvene og kontrollene (figur 4 og figur 5). I den serologiske analysen viste alle positive serumprøver en karakteristisk doseresponsiv reduksjon i signalet som tilsvarer både en høyere prøvefortynning og en lavere deteksjonsantistoffkonsentrasjon, mens signalene for de negative prøvene forble på bakgrunnsnivå. Tilsvarende, for nøytraliseringsanalysen, bemerket synkende signaler for S og RBD, men ikke Nc, økende konsentrasjoner av ACE2-konkurrenten, mens IgG-strippet serum var mye mindre påvirket av tillegg av ACE2. Pre-inkubering av perler med ACE2 i 2 min før tilsetning av serumprøven (som beskrevet i avsnitt 6 og 8), ble også sammenlignet med å kombinere perlene med ACE2 og serum samtidig og ga liten forskjell i resultatene (data ikke vist). Men fordi resultatene oppnådd med perlene pluss ACE2 pre-inkubasjonstrinn var mer konsistente, var det den endelige prosedyren som ble vedtatt for nøytraliseringsanalyseprotokollen (avsnitt 6 og 8).
Fordi det doble reportersystemet inkorporerer en annen fluorescerende reporterkanal, ble begge analysene konvertert til isotypinganalyser for samtidig å måle både IgG- og IgM-svar. Den doble reporterfunksjonaliteten til strømningsanalysatoren gjør det mulig å samle fluorescerende signaler fra to reporterdeteksjonsreagenser for hver analytt i multipleksen for hver prøve, og effektivt doble dataene som genereres per prøve i en analyse. For utvikling og optimalisering av de doble reporteranalyseprotokollene ble flere kommersielt tilgjengelige reporterfarger og deteksjonsantistoffer evaluert for den nye RP2-kanalen (figur 7 og figur 8) for å finne de beste alternativene som er tilgjengelige. Anti-IgM-antistoffet som ble konjugert med DL 405-reporterfargen, fungerte ikke bra i RP2-kanalen (figur 7), så biotin anti-IgG med SASB ble senere evaluert for deteksjon i RP2-kanalen (figur 8). Tre kombinasjoner av RP1- og RP2-deteksjonsreagenser ble sammenlignet i dual reporternøytraliseringsanalysen (tabell 1 og figur 9) for å finne de beste kombinasjonene for samtidig påvisning av IgG- og IgM-nøytraliserende antistoffer. Mens det var signifikante forskjeller i signalintensiteten mellom RP1-kanalen ved hjelp av PE-anti IgM og RP2-kanalen ved hjelp av DL 549 anti-IgM, var det ingen signifikant forskjell i målingen av prosentandelbindingshemmingen av ACE2.
Flere begrensninger i dagens metode og denne studien er anerkjent. Først ble prøvene testet og brukt i metodeutvikling og optimalisering begrenset til sett med 8-11 prøver. Flere prøver vil bli testet i utvidede studier for å bekrefte at metoden er fullt optimalisert. For det andre ble et begrenset antall reporterfluoreoriforer og reporterpar testet. Videre testing av alle tilgjengelige reportere i alle mulige kombinasjoner vil avgjøre hvilke reagenser som kan brukes med hell i denne metoden. Anti-IgG-antistoffet som ble konjugert til biotin var forskjellig fra anti-IgG-antistoffet som ble konjugert til BV 421-reporteren. Så selv om variasjon i signalintensiteten for BV 421 anti-IgG eksisterte, kan det skyldes antistoffets spesifisitet og ikke relatert til reporterfargen. Testing av andre tilgjengelige BV 421-konjugiserte antistoffer kan identifisere et annet antistoff som vil fungere godt i RP2-kanalen. Fremtidige studier vil også evaluere kombinasjonen av PE anti-IgM med BV 421 anti-human IgG for deteksjon i henholdsvis RP1 og RP2. Til slutt, selv med instrumentets doble reporterkapasitet, er analysene begrenset til to isotyper (to parametere) per reaksjon. Hvis ytterligere isotyper skal måles eller full isotyping ønskes, må ytterligere reaksjoner ved hjelp av de samme to reporterkanalene kjøres i separate brønner.
Perlebasert multipleksingsteknologi gir rask og fleksibel analysedesign med enkel implementering i rutinemessige laboratoriearbeidsflyter3,4,10. Denne studien viste hvor enkelt det var å overføre de tidligere beskrevne 3Flex serologiske og nøytraliseringsanalysene for SARS-CoV-2 til et strømningsanalysesystem for måling av IgG med en enkelt reporter, eller med liten modifikasjon, samtidig som både IgG- og IgM-svarene ble målt ved hjelp av to reportere. Alternativet for dobbel reporter har klare fordeler i forhold til enkeltreporterplattformer fordi det kan gi dobbelt så mye data per prøve, ved hjelp av halvparten av prøvevolumet, og i halvparten av antall reaksjonsbrønner. Med de riktige reporterfargene og deteksjonsantistoffene kan isotypingsanalyser enkelt utvikles og utføres på det doble reporterstrømningsanalyseinstrumentet.
The authors have nothing to disclose.
Denne rapporten ble finansiert av Luminex Corporation (Austin, TX). Forfatterne takker Matthew Silverman PhD (Biomedical Publishing Solutions, Delray Beach, FL) for vitenskapelig redigeringshjelp.
ACE2 (human) (rec.) | AdipoGen Life Sciences | AG-40B-0192-3050 | |
Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-065-098 | |
Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A7888 | Sigma-Aldrich |
Branson 1800 Cleaner/water bath sonicator | Various | ||
Brilliant Violet 421 AffiniPure Donkey Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 709-675-149 | |
Corning 96-well Black Flat Bottom Polystyrene NBS Microplate | Corning | 3650 | |
Corning 96-well Microplate Aluminum Sealing Tape, Nonsterile | Corning | 6570 | |
DyLight 405 AffiniPure Goat Anti-Human IgM, Fc5μ fragment specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-475-043 | |
DyLight 549 AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-506-129 | Discontinued but available from multiple vendors |
eBioscience Streptavidin Super Bright 436 Conjugate | ThermoFisher Scientific | 62-4317-82 | |
Fisherbrand Incubating Microplate Shaker | ThermoFisher Scientific | 02-217-757 | Fisher Scientific |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, PE | ThermoFisher Scientific | P-2771MP | |
Luminex Magnetic Plate Separator | Luminex Corporation | CN-0269-01 | |
MagPlex beads | Luminex Corporation | MC100XX-ID | |
PE AffiniPure F(ab')2 Goat Anti-Human IgM Fc5μ specific | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-116-129 | |
Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | P3813 | Sigma-Aldrich |
SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56683 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS Nucleocapsid Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56049 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein A purified |
SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56047 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS Spike Protein Antibody | Novos Biologicals | NB100-56048 | Unconjugated, rabbit, polyclonal, Protein G purified |
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike S1 Antibody, Rabbit MAb | SinoBiological | 40150-R007 | |
Sodium Azide | MilliporeSigma | S2002 | Sigma-Aldrich |
Streptavidin, R-Phycoerythrin Conjugate (SAPE) | ThermoFisher Scientific | S21388 | premium grade |
Tube Revolver/ Rotator | ThermoFisher Scientific | 88881001 | |
TWEEN 20 | MilliporeSigma | P9416 | Sigma-Aldrich |
xMAP Antibody Couplng Kit | Luminex Corporation | 40-50016 | |
xMAP INTELLIFLEX DR-SE | Luminex Corporation | INTELLIFLEX-DRSE-RUO |