Kontroll av cellgeometri genom infraröd laserassisterad mikropappersbehandling
Summary
Protokollet som presenteras här möjliggör automatiserad tillverkning av mikromönster som standardiserar cellform för att studera cytoskeletala strukturer inom däggdjursceller. Denna användarvänliga teknik kan ställas in med kommersiellt tillgängliga bildsystem och kräver inte specialiserad utrustning som är otillgänglig för vanliga cellbiologiska laboratorier.
Abstract
Micropatterning är en etablerad teknik i cellbiologigemenskapen som används för att studera samband mellan morfologi och funktion av cellulära fack samtidigt som komplikationer som härrör från naturliga cell-till-cell variationer kringgås. För att standardisera cellformen är cellerna antingen begränsade i 3D-formar eller kontrollerade för självhäftande geometri genom självhäftande öar. Traditionella mikropapperstekniker baserade på fotolitografi och djup UV-etsning beror dock starkt på rena rum eller specialiserad utrustning. Här presenterar vi en infraröd laserassisterad mikropappersteknik (microphotopatterning) modifierad från Doyle et al. som bekvämt kan ställas in med kommersiellt tillgängliga bildsystem. I detta protokoll använder vi ett Nikon A1R MP + bildsystem för att generera mikromönster med mikronprecision genom en infraröd (IR) laser som brinner förinställda regioner på poly-vinyl alkoholbelagda täcken. Vi använder ett anpassat skript för att möjliggöra automatiserad mönstertillverkning med hög effektivitet och noggrannhet i system som inte är utrustade med en automatisk fokusering av hårdvara. Vi visar att detta IR-laserassisterade mikropappersprotokoll (microphotopatterning) resulterar i definierade mönster som celler fäster uteslutande och tar önskad form. Dessutom kan data från ett stort antal celler medelvärdesförst på grund av standardiseringen av cellformen. Mönster som genereras med detta protokoll, kombinerat med högupplöst bildbehandling och kvantitativ analys, kan användas för relativt höga data flödes skärmar för att identifiera molekylära spelare som förmedlar länken mellan form och funktion.
Introduction
Cellform är en viktig determinant för grundläggande biologiska processer som vävnadsmorfogenes1, cellmigration2, cellproliferation3, och genuttryck4. Förändringar i cellformen drivs av en invecklad balans mellan dynamiska omorganiseringar av cytoskelettet som deformerar plasmamembranet och extrinsiska faktorer som yttre krafter som utövas på cellen och geometrin hos cellcells- och cellmatrisandhesioner5. Migrerande mesenkymala celler, till exempel, polymeriserar ett tätt aktinnätverk i framkant som driver plasmamembranet framåt och skapar en bred lamellipodi6, medan aktomyosinkontraktilitet drar tillbaka cellens smala efterföljande kant för att lossa cellen från sin nuvarande position7,8. Störande signalhändelser som ger upphov till sådana specialiserade cytoskeletala strukturer stör form och polaritet och saktar cellmigration9. Dessutom kräver epitelial arkbockning under gastrulation actomyosin-baserad apical förträngning som gör att celler och deras grannar blir kilformade10. Även om dessa studier belyser vikten av cellform, har den inneboende heterogeniteten i cellformen belastat ansträngningarna att identifiera mekanismer som kopplar morfologi till funktion.
För detta ändamål har många metoder för att manipulera cellform utvecklats under de senaste tre decennierna. Dessa metoder uppnår sitt mål genom att antingen begränsa cellen med en tredimensionell form eller kontrollera cellulär vidhäftningsgeometri genom mönstrad nedfall av extracellulära matrisproteiner (ECM) på en antifoulingyta, en teknik som kallas mikropapper11. Här kommer vi att granska ett antal tekniker som har blivit populära genom åren.
Soft Litografi-baserade mikrokontakttryck var ursprungligen banbrytande som ett tillvägagångssätt för mikroelektroniska tillämpningar och har otvetydigt blivit en kultfavorit12. En master wafer tillverkas först genom att selektivt exponera områden av ett fotoresistbelagt kiselsubstrat till fotoirradiation och lämnar efter sig en mönstrad yta13. En elastomer, såsom PDMS, hälls sedan på huvudskivan för att generera en mjuk “stämpel” som överför ECM-proteiner till ett önskat substrat11,14. När den är tillverkad kan en master wafer användas för att gjuta många PDMS-stämplar som ger upphov till mycket reproducerbara mikromönster12. Mönstren kan dock inte justeras lätt på grund av den långa fotolitografiprocessen. Denna process kräver också högspecialiserad utrustning och renrum som vanligtvis inte är tillgängliga i biologiavdelningar.
På senare tid har direkttryck med djup UV rapporterats kringgå begränsningar som orsakas av traditionella litografibaserade metoder. Djupt UV-ljus riktas genom en fotomask till selektiva områden i ett glaslock belagt med poly-L-lysin-ympad-polyetylenglykol. Kemiska grupper som utsätts för djup UV är fotokonverterade utan användning av ljuskänsliga länkar för att möjliggöra bindning av ECM-proteiner15. Bristen på ljuskänsliga länkar gör det möjligt för mönstrade täcken att förbli stabila vid rumstemperatur i över sju månader15. Denna metod undviker användning av renrum och fotolitografiutrustning och kräver mindre specialiserad utbildning. Kravet på fotomasker utgör dock fortfarande ett betydande hinder för experiment som kräver lättillgängliga mönsterförändringar.
Förutom metoder som manipulerar cellgeometri genom kontrollerad nedfall av ECM-proteiner på en 2D-yta, försöker andra kontrollera cellformen genom att begränsa celler i 3D-mikrostrukturer. Många studier har anpassat det mjuka litografibaserade tillvägagångssättet som beskrivs ovan för att generera 3D, snarare än 2D, PDMS-kammare för att undersöka formberoende biologiska processer i embryon, bakterier, jäst ochväxter 16,17,18,19. Två-foton polymerisation (2PP) har också tagit ledningen som en mikrofabriceringsteknik som kan skapa komplexa 3D-hydrogelställningar med nanometerupplösning20. 2PP förlitar sig på principerna om två-foton adsorption, där två fotoner levereras i femtosekonpulser absorberas samtidigt av en molekyl – fotoinitiator i detta fall – som möjliggör lokal polymerisering av fotopolymerer21. Denna teknik har använts starkt för att skriva ut 3D-byggnadsställningar som efterliknar de inhemska ECM-strukturerna i mänsklig vävnad och har visat sig inducera låg fotokemisk skada på celler22.
Debuten av mikrofotopapper för 10 år sedan gav forskare möjlighet att tillverka mikromönster samtidigt som otillgänglig och specialiserad utrustning undveks. Microphotopatterning skapar mönster på mikronskalan genom att termiskt ta bort selektiva områden av poly-vinylalkohol (PVA) belagd på aktiverade glasytor med en infraröd laser23,24. ECM-proteiner som endast fäster den underliggande glasytan och inte PVA fungerar sedan som biokemiska signaler för att möjliggöra kontrollerad spridningsdynamik och cellform. Denna metod erbjuder också överlägsen flexibilitet eftersom mönster lätt kan ändras i realtid. Här tillhandahåller vi ett steg-för-steg-protokoll för mikrofotopapper genom att använda ett kommersiellt multi-fotonavbildningssystem. Det beskrivna protokollet är utformat för snabb och automatiserad tillverkning av stora mönster. Vi visade att dessa mönster effektivt styr cellformen genom att begränsa geometrin hos cell-ECM vidhäftningar. Slutligen visar vi att den beskrivna mönstringstekniken modulerar organisationen och dynamiken i aktin cytoskeleton.
Protocol
Representative Results
Discussion
Resultaten ovan visar att det beskrivna IR-laserassisterade mikropatterning (microphotopatterning) protokollet ger reproducerbara vidhäftande mönster av olika former som möjliggör manipulering av cellform och cytoskeletal arkitektur. Även om många mikropappersmetoder har utvecklats både före och efter debuten av mikrofotopatterning, har denna metod flera fördelar. För det första kräver det inte specialiserad utrustning och renrum som vanligtvis bara finns inom tekniska avdelningar. Faktum är att eftersom mul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Connaught Fund New Investigator Award till S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (grants RGPIN-2015-05114 och RGPIN-2020-05881), University of Manchester och University of Toronto Joint Research Fund och University of Toronto XSeed Program. C.T. stöddes av NSERC USRA-stipendiet.
Materials
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane | Aldrich | 281778 | |
| 10 cm Cell Culture Dish | VWR | 10062-880 | Polysterene, TC treated, vented |
| 25X Apo LWD Water Dipping Objective | Nikon | MRD77225 | |
| 3.5 cm Cell Culture Dish | VWR | 10861-586 | Polysterene, TC treated, vented |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | Thermo | 62248 | 1mg/mL dihydrochloride solution |
| Bovine Serine Albumin | BioShop | ALB005 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Wisent | 311-425-CL | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | FC010 | 1mg/mL in pH 7.5 buffer |
| Fibronectin Antibody | BD | 610077 | Mouse |
| Fiji | ImageJ | Version 1.53c | |
| Fluorescent Phalloidin | Invitrogen | A12380 | 568nm |
| Glass Coverslip | VWR | 16004-302 | 22 × 22 mm |
| Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16220 | 25% aqueous solution |
| Hydrochloric Acid | Caledon | 6025-1-29 | 37% aqueous solution |
| IR Laser | Coherent | Chameleon Vision | |
| Minimal Essential Medium α | Gibco | 12561-056 | |
| Mounting Medium | Sigma | F4680 | |
| Mouse Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4408S | Goat, 488nm |
| Multi-Photon Microscope | Nikon | A1R MP+ | |
| Myosin Light Chain Antibody | Cell Signaling Technology | 3672S | Rabbit |
| NIS Elements | Nikon | Version 5.21.03 | |
| Nitric Acid | Caledon | 7525-1-29 | 70% aqueous solution |
| Photoshop | Adobe | Version 21.2.1 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443 | Powder |
| Poly(vinyl alchohol) | Aldrich | 341584 | MW 89000-98000, 98% hydrolyzed |
| Rabbit Secondary Antibody | Cell Signaling Technology | 4412S | Goat, 488nm |
| Shaker | VWR | 10127-876 | Alsoknown as analog rocker |
| Sodium Borohydride | Aldrich | 452882 | Powder |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | Powder |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S5011 | Powder |
| Spyder | Anaconda | 4.1.4 | |
| Trypsin | Wisent | 325-042-CL | 0.05% aqueous solution with 0.53mM EDTA |
References
- Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila. Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).
- Castor, L. N. Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells. Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).
- Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).
- Paluch, E., Heisenberg, C. -. P. Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development. Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ridley, A. J., et al. Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Cramer, L. P. Mechanism of cell rear retraction in migrating cells. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).
- Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels. Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).
- Leptin, M. Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft Lithography in Biology and Biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
- Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing. Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).
- Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions. Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).
- Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers. Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).
- Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli. Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).
- Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Mechanical Forces of Fission Yeast Growth. Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).
- Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).
- Haske, W., et al. 65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf. Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).
- Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization. Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217 (2020).
- Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix. Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).
- Doyle, A. D. Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning. Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).
- Waterman-Storer, C. M. Microtubule/Organelle Motility Assays. Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).
- Inoué, S., Spring, K. R. . Video Microscopy: The Fundamentals. , (1997).
- Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion. Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening. Scientific Reports. 7 (1), 8491 (2017).
- Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment. Organogenesis. 9 (3), 0 (2013).
