माउस मेगाकार्योसाइट प्रोजेनिटर्स का अलगाव
Summary
यह विधि चूहों फीमर, टिबियास और पेल्विक हड्डियों से एमईपी और एमकेपी के प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धि का वर्णन करती है।
Abstract
बोन मैरो मेगाकारियोसाइट्स बड़ी पॉलीप्लाइड कोशिकाएं हैं जो रक्त प्लेटलेट्स के उत्पादन को सुनिश्चित करती हैं। वे मेगाकारियोपोइसिस के माध्यम से हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न होते हैं। इस प्रक्रिया के अंतिम चरण जटिल हैं और शास्त्रीय रूप से द्विपसंती मेगाकारियोसाइट-एरिथ्रोसाइट जनक (एमईपी) और एकीपोटेंट मेगाकार्योसाइट जनक (एमकेपी) शामिल हैं। ये आबादी सदाशयी मेगाकारियोसाइट्स के गठन से पहले है और, इस प्रकार, उनके अलगाव और लक्षण वर्णन मेगाकारियोसाइट गठन के मजबूत और निष्पक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है। यह प्रोटोकॉल माउस बोन मैरो से हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को इकट्ठा करने की प्रक्रिया को विस्तार से प्रस्तुत करता है, चुंबकीय कमी के माध्यम से हेमेटोपोइटिक जनकों का संवर्धन और अंत में एक सेल छंटाई रणनीति जो अत्यधिक शुद्ध एमईपी और एमकेपी आबादी उत्पीड़ित करती है। सबसे पहले, बोन मैरो कोशिकाओं को फीमर, टिबिया, और इलियाक क्रेस्ट से भी एकत्र किया जाता है, एक हड्डी जिसमें हेमेटोपोइटिक जनकों की उच्च संख्या होती है। इलियाक क्रेस्ट हड्डियों का उपयोग प्रति माउस प्राप्त कुल सेल संख्या को काफी बढ़ाता है और इस प्रकार जानवरों के अधिक नैतिक उपयोग में योगदान देता है। एक चुंबकीय वंश की कमी को 450 एनएम चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था जिससे प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा एक बहुत ही कुशल कोशिका छंटाई की अनुमति मिली। अंत में, प्रोटोकॉल दो अत्यधिक शुद्ध मेगाकैरियोसाइट जनक आबादी की छंटाई के लिए लेबलिंग और गेटिंग रणनीति प्रस्तुत करता है: एमईपी(लिन-एससीए-1–सी-किट+सीडी 16/32–सीडी 150+सीडी9मंद)और एमकेपी (लिन– एससीए-1–सी-किट+सीडी 16/32–सीडी 150+सीडी 9उज्ज्वल ). इस तकनीक को लागू करने के लिए आसान है और मैं प्रदर्शन करने के लिए पर्याप्त सेलुलर सामग्री प्रदान करता है) उनकी पहचान और जीव विज्ञान के गहरे ज्ञान के लिए आणविक लक्षण वर्णन, ii) इन विट्रो विभेदन परख, जो मेगाकारियोसाइट्स, या iii) के परिपक्वता के तंत्र की बेहतर समझ प्रदान करेगा, जो उनके माइक्रोएनवायरमेंट के साथ बातचीत के विट्रो मॉडल में होगा।
Introduction
मेगाकारियोसाइट्स द्वारा रक्त प्लेटलेट्स पैदा किए जाते हैं। ये बड़ी पॉलीप्लाइड कोशिकाएं बोन मैरो में स्थित हैं और सभी रक्त कोशिकाओं के लिए वे हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी)1से प्राप्त होती हैं। बोन मैरो में मेगाकार्योसाइट्स के उत्पादन का शास्त्रीय मार्ग एचएससी से उत्पन्न होता है और इसमें विभिन्न जनकों का उत्पादन शामिल है जो उत्तरोत्तर उनकी भेदभाव क्षमता को सीमित करते हैं2. मेगाकैरियोसाइटिक वंश के प्रति प्रतिबद्धता पर हस्ताक्षर करने वाला पहला जनक मेगाकार्योसाइट-एरिथ्रोसाइट जनक (एमईपी) है, जो एरिथ्रोइड कोशिकाओं और मेगाकैरियोसाइट्स3,4,5दोनों का उत्पादन करने में सक्षम एक द्विपेंट जनक है। इसके बाद एमईपी एक एक एकात्मक जनक/अग्रदूत (एमकेपी) का उत्पादन करता है जो प्लेटलेट्स उत्पादन में सक्षम परिपक्व मेगाकार्योसाइट में अंतर करेगा । इन जनकों की पीढ़ी में शामिल तंत्र, साथ ही मेगाकारियोसाइट्स में उनके भेदभाव और परिपक्वता जटिल हैं और केवल आंशिक रूप से समझ में आते हैं। इसके अलावा, भेदभाव क्षमता और इन कोशिकाओं के आंतरिक प्रतिबद्धता स्तर के मामले में एमईपी आबादी की विषमता अभी भी अस्पष्ट है । इन प्रक्रियाओं को समझने के लिए, ठीक आणविक और एकल कोशिका विश्लेषण के लिए एमईपी और एमकेपी की शुद्ध आबादी (या पहुंच प्राप्त करना) आवश्यक है।
कई अध्ययनों में माउस 6 , 7,8में मेगाकारियोसाइटिक वंश के लिए प्रतिबद्ध जनकों की पहचान के लिए कोशिका सतह मार्कर के विशेषसंयोजनोंका प्रदर्शन किया गया है । इन से चूहों से एमईपी और एमकेपी के शुद्धिकरण की अनुमति देने के लिए एक विधि तैयार की गई थी। इस विधि को बड़ी संख्या में परख के लिए पर्याप्त संख्या और गुणवत्ता में कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। मन में नैतिक विचारों के साथ, और प्रयोगों में शामिल जानवरों की संख्या को कम करने के लिए, हम फीमर और टिबिया से अस्थि मज्जा फसल के लिए, और भी iliac शिखा से प्राप्त । इस हड्डी में उच्च आवृत्ति और हेमेटोपोइटिक जनकों की संख्या होती है और लंबी हड्डी कटाई के दौरान अधिकांश समय क्षतिग्रस्त होता है। यहां प्रस्तुत इस हड्डी के विश्वसनीय संग्रह के लिए एक विस्तृत विधि है।
अनुकूलन का दूसरा मापदंड अत्यधिक शुद्ध कोशिका आबादी का उत्पादन करना है। फ्लोरोसेंट एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएस) ब्याज की कोशिकाओं की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए पसंद की एक विधि है। हालांकि, कम पैदावार तक पहुंच रहे है जब ब्याज की सेल आबादी बहुत दुर्लभ है । इस प्रकार संवर्धन प्रक्रियाएं आवश्यक हैं । इस प्रोटोकॉल में, चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके एक नकारात्मक चयन प्रक्रिया का विकल्प चुना गया था।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पेपर में वर्णित विधि माउस एमईपी और एमकेपी के निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए अनुमति देती है। प्रोटोकॉल के अनुकूलन में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर पर्याप्त संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करना था जो अधिका…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक तकनीकी सहायता के लिए मोनिक फ्रायंड, कैथरीन जैसेल और केट्टी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को एआरएमईएसए (एसोसिएशन डी रेचेचे एट डेवेलोपमेंट एन मेडेसिन एट सैंटे पब्लिक द्वारा समर्थित किया गया था), और ग्रांट एएनआर-17-सीई14-0001-01 द्वारा Henri.de ला। साले।
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
References
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