मेगाकारियोसाइट विभेदन और प्लेटलेट गठन का अध्ययन करने के लिए सेल स्रोत के रूप में ल्यूकोडेप्लेशन फिल्टर्स-व्युत्पन्न सीडी 34 + कोशिकाएं
Summary
इस प्रोटोकॉल में ल्यूकोफिल्टर-व्युत्पन्न सीडी 34 + हेमेटोपोइटिक प्रोजेनिटर्स और उनके इन विट्रो भेदभाव और परिपक्वता को प्रोपलेटलेट-असर मेगाकारियोसाइट्स में प्राप्त करने में शामिल सभी चरणों का विस्तार से वर्णन किया गया है जो संस्कृति माध्यम में प्लेटलेट्स जारी करने में सक्षम हैं। यह प्रक्रिया मेगाकारियोपोइसिस को नियंत्रित करने वाले सेलुलर और आणविक तंत्र के गहन विश्लेषण के लिए उपयोगी है।
Abstract
इन विट्रो विस्तार और मानव हेमेटोपोइटिक जनकों के विभेदकों को प्रोपलेटलेट्स को लम्बा करने और प्लेटलेट्स जारी करने में सक्षम होने से प्लेटलेट्स बायोजेनेसिस अंतर्निहित तंत्र का गहन अध्ययन होता है। उपलब्ध संस्कृति प्रोटोकॉल ज्यादातर अस्थि मज्जा या गर्भनाल रक्त से प्राप्त हेमेटोपोइटिक जनकों पर आधारित होते हैं जो कई नैतिक, तकनीकी और आर्थिक चिंताओं को बढ़ाते हैं। यदि परिधीय रक्त से CD34 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए पहले से ही उपलब्ध प्रोटोकॉल हैं, तो यह पांडुलिपि रक्त केंद्रों में आसानी से उपलब्ध ल्यूकोडेप्लेशन फिल्टर से सीडी 34 + कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक सीधा और अनुकूलित प्रोटोकॉल का प्रस्ताव करती है। इन कोशिकाओं को आठ रक्तदान के अनुरूप रक्त आधान उत्पादों की तैयारी में उपयोग किए जाने वाले ल्यूकोडेप्लेशन फिल्टर से अलग किया जाता है। इन फिल्टरों को त्यागने के लिए होती है। इन फ़िल्टर से सीडी 34 + कोशिकाओं के रूप में पहचाने गए हेमेटोपोइटिक प्रोजेनिटर एकत्र करने के लिए एक विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स को प्राप्त करने की विधि उनके फेनोटाइपिक विकास पर चर्चा करते हुए प्रोपलेटलेट्स का विस्तार करने की विधि भी विस्तृत है। अंत में, प्रोटोकॉल एक कैलिब्रेटेड पाइपटिंग विधि प्रस्तुत करता है, जो प्लेटलेट्स को कुशलतापूर्वक जारी करता है जो मूल लोगों के समान रूप से और कार्यात्मक रूप से होते हैं। यह प्रोटोकॉल अंतर्निहित तंत्रों को विच्छेदन करने और वीवो प्लेटलेट पैदावार में दृष्टिकोण करने के लिए प्रक्रिया के विभिन्न चरणों में कार्य करने वाले औषधीय यौगिकों का मूल्यांकन करने के लिए एक आधार के रूप में काम कर सकता है।
Introduction
रक्त प्लेटलेट्स विशेष बड़े पॉलीप्लाइड कोशिकाओं, मेगाकारियोसाइट्स (एमके) से आते हैं, जो मेगाकारियोपोइसिसिस (एमकेपी) के रूप में जाना जाने वाला निरंतर और ठीक-ठाक उत्पादन प्रक्रिया से उत्पन्न होता है। इस प्रक्रिया के शीर्ष पर हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल हैं, जो बोन मैरो पर्यावरण (साइटोकिन्स, ट्रांसक्रिप्शन कारकों, हेमेटोपोइटिक आला) के संपर्क में हैं, जो मेगाकारियोसाइटिक मार्ग की ओर प्रतिबद्ध करने में सक्षम हो जाएंगे और हेमेटोपोइटिक जनक (एचपी) में अंतर कर सकते हैं, जिससे अपरिपक्व एमकेएस1को जन्म मिलेगा। विभिन्न साइटोकिन्स के प्रभाव में, और विशेष रूप से थ्रोम्बोपोइटिन (टीपीओ), जो एमकेपी का प्रमुख साइटोकिन है; एमके को परिपक्वता के दो प्रमुख चरणों से गुजरना होगा: एंडोमेट्रियोसिस और सीमांकन झिल्ली (डीएमएस) का विकास। यह पूरी तरह से परिपक्व एमके तब एक साइनसॉइड पोत के करीब दिखाई देता है जिसमें यह साइटोप्लाज्मिक एक्सटेंशन, प्रॉप्लेलेट्स उत्सर्जित कर सकता है, जिसे रक्त प्रवाह के तहत जारी किया जाएगा और बाद में कार्यात्मक प्लेटलेट्स2में फिर से तैयार किया जाएगा। 19943 में टीपीओ की क्लोनिंग ने एचपी भेदभाव और एमके परिपक्वता की अनुमति देने वाली इन विट्रो संस्कृति तकनीकों के विकास में तेजी लाकर एमकेपी के अध्ययन में बढ़ावा दिया।
प्लेटलेट की संख्या (वृद्धि या कमी) और कार्य4,5दोनों के संदर्भ में रक्त प्लेटलेट्स को प्रभावित करने वाली कई विकृतियां हैं। मानव हिमाचल प्रदेश से विट्रो में MKP को पुनः प्राप्त करने में सक्षम होने के नाते आणविक और सेलुलर इस प्रक्रिया अंतर्निहित तंत्र और अंततः रोगियों के चिकित्सीय प्रबंधन की समझ में सुधार हो सकता है ।
मानव एचपी के विभिन्न स्रोत उपयुक्त हैं: कॉर्ड रक्त, अस्थि मज्जा, और परिधीय रक्त6,7,8। परिधीय रक्त से हिमाचल प्रदेश की कटाई गर्भनाल रक्त या अस्थि मज्जा से उनकी वसूली की तुलना में कम सैंय और नैतिक समस्याओं को उठाती है । हिमाचल प्रदेश ल्यूकाफेरसिस या बफी कोट से बरामद किया जा सकता है, लेकिन ये स्रोत महंगे हैं और रक्त केंद्रों में हमेशा उपलब्ध नहीं होते हैं। अन्य प्रोटोकॉल, कम खर्चीला और प्रदर्शन करने में आसान, मानव परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) की सीधी वसूली की अनुमति देतेहैं,बिना पूर्व सीडी 34 संचालित अलगाव4,8की आवश्यकता के बिना। हालांकि, इस विधि के साथ मेगाकारियोसाइट्स की शुद्धता संतोषजनक नहीं है और एमके में इष्टतम भेदभाव के लिए पीएमसी से सीडी 34 + कोशिकाओं के चयन की सिफारिश की जाती है। इससे हमें ल्यूकोरेडक्शन फिल्टर (एलआरएफ) से एचपी शुद्धिकरण लागू करने के लिए नेतृत्व किया गया, जो नियमित रूप से रक्त बैंकों में सफेद रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए उपयोग किया जाता है और इस प्रकार प्रतिकूल प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं से बचता है9। दरअसल, १९९८ के बाद से, प्लेटलेट ध्यान केंद्रित स्वचालित रूप से फ्रांस में leukodepleted किया गया है । इस प्रक्रिया के अंत में, एलआरएफ को छोड़ दिया जाता है और एलआरएफ में बनाए गए सभी कोशिकाओं को नष्ट कर दिया जाता है। इसलिए, एलआरएफ में कोशिकाएं किसी अतिरिक्त कीमत पर आसानी से उपलब्ध हैं। एलआरएफ के पास ल्यूकाफेरेसिस या बफी कोट द्वारा प्राप्त एक सेलुलर सामग्री है, विशेष रूप से सीडी 34 + एचपी की उनकी संरचना में उन्हें एक उल्लेखनीय आकर्षक स्रोत10बना रहा है। मानव एचपी स्रोत के रूप में एलआरएफ को पहले ही अक्षुण्ण कार्यात्मक क्षमताओं के साथ कोशिकाओं को उपलब्ध कराने के लिए प्रदर्शित किया जा चुका है11. इस स्रोत प्रयोगशाला अनुसंधान के लिए प्रचुर मात्रा में और सस्ती होने का लाभ है। इस संदर्भ में, यह लेख क्रमिक रूप से वर्णन करता है: i) LRFs से CD34+ HP का निष्कर्षण और चयन; ii) एक दो चरण अनुकूलित संस्कृति, जो मेगाकारियोसाइटिक मार्ग में एचपी की प्रतिबद्धता और प्रोपलेटलेट उत्सर्जित करने में सक्षम एमके की परिपक्वता को पुनः प्राप्त करती है; iii) इन एमके से प्लेटलेट्स को कुशलतापूर्वक जारी करने के लिए एक विधि; और iv) फेनोटाइपिंग एमके और सुसंस्कृत प्लेटलेट्स के लिए एक प्रक्रिया।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल रक्त-व्युत्पन्न एचपी से प्रोपलेट्स उत्सर्जित करने और संस्कृति माध्यम से प्लेटलेट्स जारी करने में सक्षम एमके के उत्पादन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। एचपी एलआरएफ, रक्त बैंकों के एक उप-उ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को एएनआर (एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे) ग्रांट एएनआर-17-CE14-0001-1 द्वारा समर्थित किया गया है ।
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
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