Filtri leucodeplezione-Cellule CD34+ derivate come fonte cellulare per studiare la differenziazione dei megacariociti e la formazione piastrinica
Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie per ottenere i progenitori ematopoietici CD34+ derivati dal leucofiltro e la loro differenziazione e maturazione in vitro in megacariociti portatori di proplatelet che sono in grado di rilasciare piastrine nel terreno di coltura. Questa procedura è utile per l’analisi approfondita dei meccanismi cellulari e molecolari che controllano la megacariopoiesi.
Abstract
L’espansione e la differenziazione in vitro di progenitori ematopoietici umani in megacariociti in grado di allungare i proplatatori e rilasciare piastrine consente uno studio approfondito dei meccanismi alla base della biogenesi piastrinica. I protocolli di coltura disponibili si basano principalmente su progenitori ematopoietici derivati dal midollo osseo o dal sangue del cordone ombelicale che sollevano una serie di preoccupazioni etiche, tecniche ed economiche. Se ci sono già protocolli disponibili per ottenere cellule CD34 dal sangue periferico, questo manoscritto propone un protocollo semplice e ottimizzato per ottenere cellule CD34 + da filtri leucodeplezione prontamente disponibili nei centri del sangue. Queste cellule sono isolate dai filtri leucodepletici utilizzati nella preparazione di prodotti trasfusionali, corrispondenti a otto donazioni di sangue. Questi filtri sono pensati per essere scartati. Viene descritta una procedura dettagliata per raccogliere progenitori ematopoietici identificati come cellule CD34+ da questi filtri. Il metodo per ottenere megacariociti maturi che estendono i proplati mentre discutono della loro evoluzione fenotipica è anche dettagliato. Infine, il protocollo presenta un metodo di pipettaggio calibrato, per rilasciare in modo efficiente piastrine morfologicamente e funzionalmente simili a quelle native. Questo protocollo può servire come base per valutare i composti farmacologici che agiscono in varie fasi del processo per sezionare i meccanismi sottostanti e avvicinarsi alle rese piastriniche in vivo.
Introduction
Le piastrine del sangue provengono da grandi cellule poliploidi specializzate, i megacariociti (MK), che provengono da un processo di produzione costante e messo a punto noto come megacariopoiesi (MKP). All’apice di questo processo ci sono le cellule staminali ematopoietiche che, a contatto con l’ambiente del midollo osseo (citochine, fattori di trascrizione, nicchia ematopoietica), saranno in grado di proliferare e differenziarsi in progenitori ematopoietici (HP) in grado di impegnarsi verso la via megacariocitica, dando origine a NK immaturi1. Sotto l’influenza di varie citochine, e in particolare della trombopoietina (TPO), che è la principale citochina di MKP; l’MK subirà quindi due principali fasi di maturazione: l’endomitosi e lo sviluppo delle membrane di demarcazione (DMS). Questo MK completamente maturo appare quindi vicino a un vaso sinusoide in cui può emettere estensioni citoplasmatiche, le proplatelet, che verranno rilasciate sotto il flusso sanguigno e successivamente rimodellate in piastrine funzionali2. La clonazione di TPO nel 19943 ha fornito una spinta nello studio di MKP accelerando lo sviluppo di tecniche di coltura in vitro che consentono la differenziazione HP e la maturazione MK.
Ci sono molte patologie che colpiscono le piastrine del sangue, sia in termini di numero di piastrine (aumento o diminuzione) che di funzione4,5. Essere in grado di ricapitolare MKP in vitro da HP umano potrebbe migliorare la comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari alla base di questo processo e, in definitiva, la gestione terapeutica dei pazienti.
Sono adatte varie fonti di HP umano: sangue cordonale, midollo osseo e sangue periferico6,7,8. La raccolta di HP dal sangue periferico solleva meno problemi logistici ed etici rispetto al loro recupero dal sangue del cordone ombelicale o dal midollo osseo. L’HP può essere recuperato dalla leucoaferesi o dal buffy coat, ma queste fonti sono costose e non sempre disponibili nei centri del sangue. Altri protocolli, meno costosi e più facili da eseguire, consentono il recupero diretto delle cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) senza la necessità di un precedente isolamento guidato da CD344,8. Tuttavia, la purezza dei megacariociti non è soddisfacente con questo metodo e una selezione di cellule CD34 + da PBMC è raccomandata per una differenziazione ottimale in MK. Questo ci ha portato a implementare una purificazione HP da filtri a leucoriduzione (LRF), abitualmente utilizzati nelle banche del sangue per rimuovere i globuli bianchi ed evitare così reazioni immunologiche avverse9. Infatti, dal 1998, i concentrati piastrinici sono stati automaticamente leucodepliati in Francia. Alla fine di questo processo, gli LRF vengono scartati e tutte le cellule trattenute nell’LRF vengono distrutte. Le celle nei LRF sono, quindi, prontamente disponibili senza costi aggiuntivi. Gli LRF hanno un contenuto cellulare vicino a quello ottenuto dalla leucaferesi o in buffy coats, in particolare nella loro composizione di CD34+ HP che li rende una fonte notevolmente attraente10. LRF come fonte umana di HP ha già dimostrato di fornire alle cellule capacità funzionali intatte11. Questa fonte ha il vantaggio di essere abbondante e conveniente per la ricerca di laboratorio. In questo contesto, questo articolo descrive successivamente: i) l’estrazione e la selezione di CD34+ HP da LRF; ii) una coltura ottimizzata in due fasi, che ricapitola l’impegno di HP nella via megacariocitica e la maturazione di MK in grado di emettere proplatelet; iii) un metodo per rilasciare in modo efficiente piastrine da questi MK; e iv) una procedura per la fenotipizzazione di MK e piastrine coltivate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive un metodo per la produzione di MK in grado di emettere proplatelet da HP derivati dal sangue e di rilasciare piastrine dal terreno di coltura. Gli HP sono ottenuti da LRF, un sottoprodotto delle banche del sangue, utilizzato per rimuovere i leucociti contaminanti dagli emoderivati cellulari ed evitare reazioni avverse. Sebbene questo metodo sia relativamente semplice, alcuni punti meritano un’attenzione speciale.
La deposizione della sospensione cellulare sul mezzo d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR- 17-CE14-0001-1.
Materials
| 7-AAD | Biolegend | 558819 | |
| ACD | EFS-Alsace | NA | |
| Anti-CD34-PE | Miltenyi biotec | 130-081-002 | |
| Anti-CD34-PECy7 | eBioscience | 25-0349-42 | |
| Anti-CD41-Alexa Fluor 488 | Biolegend | 303724 | |
| Anti-CD42a-PE | BD Bioscience | 559919 | |
| Apyrase | EFS-Alsace | NA | |
| BD Trucount Tubes | BD Bioscience | 340334 | |
| CD34 MicroBead Kit UltraPure, human | Miltenyi biotec | 130-100-453 | |
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.OR | Or equivalent material |
| Compteur ADAM | DiagitalBio | NA | Or equivalent material |
| Cryotubes | Dutscher | 55002 | Or equivalent material |
| Dextran from leuconostoc spp | Sigma | 31392-50g | Or equivalent material |
| DMSO Hybri-max | Sigma | D2650 | |
| EDTA 0.5 M | Gibco | 15575-039 | |
| Eppendorf 1,5 mL | Dutscher | 616201 | Or equivalent material |
| Filtration unit Steriflip PVDF | Merck Millipore Ltd | SE1M179M6 | |
| Flow Cytometer | BD Bioscience | Fortessa | |
| Human LDL | Stemcell technologies | #02698 | |
| ILOMEDINE 0,1 mg/1 mL | Bayer | MA038EX | |
| Inserts | Fenwal | R4R1401 | Or equivalent material |
| Laminar flow hood | Holten | NA | Archived product |
| LS Columms | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| Lymphoprep | Stemcell | 7861 | |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PBS (-) | Life Technologies | 14190-169 | Or equivalent material |
| PGi2 | Sigma | P6188 | |
| Poches de transferts 600ml | Macopharma | VSE4001XA | |
| Pre-Separation Filters (30µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| StemRegenin 1 (SR1) | Stemcell technologies | #72344 | |
| StemSpan Expansion Supplement (100x) | Stemcell technologies | #02696 | |
| StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Stericup Durapore 0,22µm PVDF | Merck Millipore Ltd | SCGVU05RE | |
| SVF Hyclone | Thermos scientific | SH3007103 | |
| Syringues 30 mL | Terumo | SS*30ESE1 | Or equivalent material |
| Syringe filters Millex 0,22µM PVDF | Merck Millipore Ltd | SLGV033RB | |
| TPO | Stemcell technologies | #02822 | |
| Tubes 50 mL | Sarstedt | 62.548.004 PP | Or equivalent material |
| Tubes 15 mL | Sarstedt | 62.554.001 PP | Or equivalent material |
| Tubulures | B Braun | 4055137 | Or equivalent material |
References
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