ديناميات تشكيل الصفائح الدموية من الفأر نخاع العظم الطازج Explants
Summary
هنا، ونحن بالتفصيل طريقة explant نخاع العظم، من إعداد العينة لتحليل الشريحة المجهرية، لتقييم قدرة megakaryocytes التي تمايزت في بيئتها الفسيولوجية لتشكيل الصفائح.
Abstract
المرحلة الأخيرة من megakaryopoiesis يؤدي إلى ملحقات السيتوبلازمية من megakaryocytes ناضجة، ما يسمى proplatelets. وقد تم تعلم الكثير عن تشكيل البربليتليت باستخدام في المختبر– megakaryocytes المتمايزة؛ ومع ذلك ، هناك أدلة متزايدة على أن نظم الثقافة التقليدية لا تلخص بأمانة عملية التمايز / النضج التي تأخذ أماكن داخل نخاع العظام. في هذه المخطوطة، نقدم طريقة تفسيرية وصفها في البداية في عام 1956 من قبل ثيري وسيس لتصور الخلايا الضخمة التي نضجت في بيئتها الأصلية، وبالتالي التحايل على القطع الأثرية المحتملة والتفسيرات الخاطئة. يتم جمع نخاع العظم الطازج عن طريق مسح عظم الفخذ من الفئران، وشرائح إلى أقسام عرضية 0.5 ملم، ووضعها في غرفة حضانة في 37 درجة مئوية تحتوي على عازل الفسيولوجية. تصبح الخلايا الضخمة مرئية تدريجيا في المحيط المكشوف ويتم ملاحظتها حتى 6 ساعات تحت مجهر مقلوب إلى جانب كاميرا فيديو. مع مرور الوقت ، تغير الخلايا الضخمة شكلها ، مع بعض الخلايا التي لها شكل كروي والبعض الآخر تطوير ملحقات سميكة أو تمديد العديد من الصفائح الرفيعة مع تفريع واسع النطاق. وتجرى تحقيقات نوعية وكمية على السواء. هذه الطريقة لديها ميزة كونها بسيطة، استنساخها، وبسرعة كما megakaryocytes عديدة موجودة، وكلاسيكيا نصفها شكل proplatelets في 6 ساعات مقارنة مع 4 أيام لmegakaryocytes الماوس المثقف. بالإضافة إلى دراسة الفئران المتحولة ، فإن التطبيق المثير للاهتمام لهذه الطريقة هو التقييم المباشر للعوامل الدوائية على عملية تمديد الصفائح الدموية ، دون التدخل في عملية التمايز التي قد تحدث في الثقافات.
Introduction
تم تطوير تقنية explant نخاع العظم لأول مرة من قبل ثيري واسيس في عام 1956 لوصف تشكيل ملحقات السيتوبلازمية megakaryocyte الفئران كحدث أولي في تشكيل الصفائح الدموية1. باستخدام النقيض من المرحلة والتقنيات السينمائية ، وصف هؤلاء المؤلفون تحويل الخلايا الضخمة المستديرة الناضجة إلى خلايا خثارية “تشبه الحبار” مع ملحقات السيتوبلازمية التي تظهر حركات ديناميكية للاستطالة والانكماش. تصبح هذه الأسلحة أرق تدريجيا حتى تصبح شكل خيوط مع تورمات صغيرة على طول الذراعين وعلى النصائح. هذه الاستطالات megakaryocyte نموذجية، التي تم الحصول عليها في المختبر وفي وسائل الإعلام السائلة، لديها بعض أوجه التشابه مع الصفائح الدموية لوحظ في نخاع العظام الثابتة، حيث megakaryocytes تبرز امتدادات طويلة من خلال الجدران sinusoid في الدورة الدموية2،3. اكتشاف والاستنساخ من TPO في عام 1994، سمح للتمييز بين megakaryocytes في الثقافة قادرة على تشكيل ملحقات proplatelet تشبه تلك الموصوفة في نخاع العظم explants4،5،6. ومع ذلك ، فإن نضوج megakaryocyte أقل كفاءة بكثير في ظروف الثقافة ، ولا سيما شبكة الأغشية الداخلية الواسعة من خلايا العظم الضخمة الناضجة المتخلفة في الخلايا الضخمة المستزرعة ، مما يعيق الدراسات على آليات التكوين الحيوي للصفائح الدموية7،8.
نحن بالتفصيل هنا نموذج explant نخاع العظم، استنادا إلى ثيري واسيس، لمتابعة في الوقت الحقيقي تشكيل proplatelet من الخلايا العملاقة الماوس، والتي نضجت تماما في بيئتها الأصلية، وبالتالي التحايل على القطع الأثرية في المختبر ممكن وسوء التفسير. يتم تقديم النتائج التي تم الحصول عليها في الفئران البالغة البرية لتوضيح قدرة الخلايا العملاقة على تمديد الصفائح ، ومورفولوجياها وتعقيد الصفائح. كما نقدم استراتيجية قياس سريع للتحقق من الجودة لضمان دقة البيانات ومتانتها خلال عملية تسجيل الخلايا الضخمة. البروتوكول المعروض هنا هو أحدث إصدار من الأسلوب المنشور كفصل كتاب سابقا9.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نحن نصف طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة في المختبر لتقييم كفاءة الخلايا الضخمة لتوسيع الصفائح التي نمت في نخاع العظام. نموذج نخاع العظم explant للفأر لديه أربع مزايا رئيسية. أولا، لا توجد مهارات تقنية متقدمة مطلوبة. ثانيا، الوقت اللازم للحصول على صفائح عملاقة تمتد كريات الدم قصيرة جدا، ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا جان إيف رينكل وجولي بوشر وباتريشيا لاوفر ومونيك فرويند وكيتي كنيز – هيبرت على المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل من قبل ANR (وكالة الوطنية للريشة) منح ANR-17-CE14-0001-01 و ANR-18-CE14-0037.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
