Proplatelet Dannelse Dynamics af musen frisk knoglemarvs explants
Summary
Her beskriver vi knoglemarvseksplantersmetoden, fra prøvepræparat til mikroskopisk diasanalyse, for at evaluere megakaryocytternes evne til at danne proplatelets.
Abstract
Den sidste fase af megakaryopoiesis fører til cytoplasmaiske udvidelser fra modne megakaryocytter, de såkaldte proplatelets. Meget er blevet lært om proplatelet formation ved hjælp af in vitro-differentieredemegakaryocytter; der er dog en stigende dokumentation for, at konventionelle kultursystemer ikke trofast generobrer den differentierings-/modningsproces, der finder sted inde i knoglemarven. I dette manuskript præsenterer vi en explant metode oprindeligt beskrevet i 1956 af Thiéry og Bessis at visualisere megakaryocytter, som er modnet i deres oprindelige miljø, og dermed omgå potentielle artefakter og fejlfortolkninger. Friske knoglemarv opsamles ved at skylle lårbenene på mus, skæres i 0,5 mm tværsnit og placeres i et inkubationskammer ved 37 °C, der indeholder en fysiologisk buffer. Megakaryocytter bliver gradvist synlige i eksplantens periferi og observeres op til 6 timer under et omvendt mikroskop koblet til et videokamera. Over tid ændrer megakaryocytter deres form, hvor nogle celler har en sfærisk form, og andre udvikler tykke udvidelser eller udvider mange tynde proplatelets med omfattende forgrening. Der gennemføres både kvalitative og kvantitative undersøgelser. Denne metode har den fordel at være enkel, reproducerbar, og hurtigt som mange megakaryocytter er til stede, og klassisk halvdelen af dem danner proplatelets i 6 timer i forhold til 4 dage for kultiverede mus megakaryocytter. Ud over studiet af mutantmus er en interessant anvendelse af denne metode den enkle evaluering af de farmakologiske agenser på proplateletudvidelsesprocessen uden at forstyrre den differentieringsproces, der kan forekomme i kulturer.
Introduction
Knoglemarvseksplanter teknik blev først udviklet af Thiéry og Bessis i 1956 til at beskrive dannelsen af rotte megakaryocyt cytoplasmaiske udvidelser som en indledende begivenhed i blodplade dannelse1. Ved hjælp af fasekontrast og filmiske teknikker karakteriserede disse forfattere omdannelsen af modne runde megakaryocytter til “blækspruttelignende” trombocytogene celler med cytoplasmaiske udvidelser, der viser dynamiske bevægelser af forlængelse og sammentrækning. Disse arme bliver gradvist tyndere, indtil de bliver filiform med små hævelser langs armene og ved spidserne. Disse typiske megakaryocyt forlængelser, opnået in vitro og i flydende medier, har visse ligheder med blodplader observeret i fast knoglemarv, hvor megakaryocytter stikker lange udvidelser gennem sinusoide vægge ind i blodcirkulationen2,3. Opdagelsen og kloning af TPO i 1994, lov til at differentiere megakaryocytter i kultur i stand til at danne proplatelet udvidelser ligner dem, der er beskrevet i knoglemarvs explants4,5,6. Men megakaryocyt modning er langt mindre effektiv i kulturforhold, især den omfattende interne membran netværk af knoglemarvs modnet megakaryocytter er underudviklet i kultiverede megakaryocytter, hæmmer undersøgelser af mekanismerne i blodplade biogenese7,8.
Vi detaljer her knoglemarvs explant model, baseret på Thiéry og Bessis, at følge i realtid proplatelet dannelse af mus megakaryocytter, som har fuldt modnet i deres oprindelige miljø, og dermed omgå mulige in vitro artefakter og fejlfortolkninger. Resultater opnået i vilde voksne mus præsenteres for at illustrere megakaryocyts evne til at udvide proplatelets, deres morfologi og kompleksiteten af proplatelets. Vi introducerer også en hurtig kvantificeringsstrategi for kvalitetsvalidering for at sikre datanøjagtighed og robusthed under megakaryocyt-optagelsesprocessen. Protokollen præsenteres her er den seneste version af den metode, der er udgivet som en bog kapitel tidligere9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her beskriver vi en enkel og billig in vitro-metode til at evaluere effektiviteten af megakaryocytter for at udvide proplatelets, der er vokset i knoglemarven. Knoglemarven explant model for mus har fire vigtigste fordele. For det første er der ingen avancerede tekniske færdigheder, der kræves. For det andet er den tid, der er nødvendig for at opnå megakaryocyt-udvidelse proplatelets ganske kort, kun 6 timer for explant metode, sammenlignet med mindst 4 dage for en konventionel kultur metode startende fra m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert for teknisk bistand. Dette arbejde er blevet støttet af ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 og ANR-18-CE14-0037.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
