Динамика образования проплатлетов эксплантов костного мозга мыши
Summary
Здесь мы подробно описываем метод эксплантации костного мозга, от пробоподготовки до микроскопического анализа слайдов, для оценки способности мегакариоцитов, которые дифференцировались в своей физиологической среде, образовывать проплацелеты.
Abstract
Последняя стадия мегакариопоэтиса приводит к цитоплазматическим расширениям из зрелых мегакариоцитов, так называемых проплацелетов. Многое было изучено о формировании проплатлетов с использованием in vitro-дифференцированных мегакариоцитов; однако появляется все больше доказательств того, что традиционные системы культивирования не точно повторяют процесс дифференцировки/созревания, который происходит внутри костного мозга. В этой рукописи мы представляем метод эксплантата, первоначально описанный в 1956 году Тьери и Бессисом для визуализации мегакариоцитов, которые созрели в своей родной среде, тем самым обходя потенциальные артефакты и неправильные интерпретации. Свежие костные мозги собирают путем промывки бедренных костей мышей, нарезают на поперечные сечения 0,5 мм и помещают в инкубационную камеру при 37 °C, содержащую физиологический буфер. Мегакариоциты постепенно становятся видимыми на периферии экспланта и наблюдаются до 6 часов под перевернутым микроскопом, соединенным с видеокамерой. Со временем мегакариоциты меняют свою форму, причем некоторые клетки имеют сферическую форму, а другие развивают толстые расширения или расширяют множество тонких пластин с обширным ветвлением. Проводятся как качественные, так и количественные исследования. Этот метод имеет то преимущество, что он прост, воспроизводим и быстр, так как присутствуют многочисленные мегакариоциты, и классически половина из них образует проплацелеты за 6 часов по сравнению с 4 днями для культивируемых мышиных мегакариоцитов. В дополнение к изучению мышей-мутантов, интересным применением этого метода является прямая оценка фармакологических агентов в процессе расширения проплатлетов, не вмешиваясь в процесс дифференцировки, который может происходить в культурах.
Introduction
Метод эксплантации костного мозга был впервые разработан Тьери и Бессисом в 1956 году для описания формирования цитоплазматических расширений мегакариоцитов крыс как начального события в образовании тромбоцитов1. Используя фазовый контраст и кинематографические методы, эти авторы охарактеризовали трансформацию зрелых круглых мегакариоцитов в «кальмароподобные» тромбоцитогенные клетки с цитоплазматическими расширениями, показывающими динамические движения удлинения и сокращения. Эти руки становятся все тоньше, пока не станут нитевидными с небольшими отеками вдоль рук и на кончиках. Эти типичные удлинения мегакариоцитов, полученные in vitro и в жидких средах, имеют определенное сходство с тромбоцитами, наблюдаемыми в фиксированном костном мозге, где мегакариоциты выступают длинными расширениями через синусоидальные стенки в кровообращение2,3. Открытие и клонирование ТПО в 1994 г. позволило дифференцировать мегакариоциты в культуре, способные образовывать расширения проплатлетов, напоминающие описанные в костном мозговых эксплантатах4,5,6. Однако созревание мегакариоцитов гораздо менее эффективно в условиях культивирования, в частности, обширная внутренняя мембранная сеть зрелых мегакариоцитов костного мозга недоразвита в культивированных мегакариоцитах, что затрудняет исследования механизмов биогенеза тромбоцитов7,8.
Здесь мы подробно описываем модель экспланта костного мозга, основанную на Тьери и Бессисе, чтобы проследить в реальном времени за образованием проплатлетов мышиных мегакариоцитов, которые полностью созрели в своей родной среде, тем самым обходя возможные артефакты in vitro и неправильные интерпретации. Представлены результаты, полученные у взрослых мышей дикого типа, иллюстрирующие способность мегакариоцитов к расширению проплацетов, их морфологию и сложность проплацелетов. Мы также внедряем стратегию быстрой количественной оценки для проверки качества для обеспечения точности и надежности данных в процессе регистрации мегакариоцитов. Протокол, представленный здесь, является самой последней версией метода, опубликованной в виде главы книгиранее 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем простой и недорогой метод in vitro для оценки эффективности мегакариоцитов для расширения процибетов, выросших в костном мозге. Модель эксплантата костного мозга для мышей имеет четыре основных преимущества. Во-первых, не требуются продвинутые технические навыки. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Жана-Ива Ринкеля, Жюли Бошер, Патрисию Лоффер, Моник Фройнд, Кетти Кнез-Хипперт за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом ANR (Agence National de la Recherche) ANR-17-CE14-0001-01 и ANR-18-CE14-0037.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
