Dinámica de formación de proplatlets de explantes de médula ósea fresca de ratón
Summary
Aquí, detallamos el método de explante de médula ósea, desde la preparación de muestras hasta el análisis microscópico de diapositivas, para evaluar la capacidad de los megacariocitos que se han diferenciado en su entorno fisiológico para formar proplatlets.
Abstract
La última etapa de la megacaropoyesis conduce a extensiones citoplasmáticas de megacariocitos maduros, los llamados proplatlets. Mucho se ha aprendido sobre la formación de proplatlet utilizando megacariocitosdiferenciados in vitro; sin embargo, existe una creciente evidencia de que los sistemas de cultivo convencionales no recapitulan fielmente el proceso de diferenciación/maduración que tiene lugar dentro de la médula ósea. En este manuscrito, presentamos un método de explante descrito inicialmente en 1956 por Thiéry y Bessis para visualizar megacariocitos que han madurado en su entorno nativo, evitando así posibles artefactos y malas interpretaciones. Las médulas óseas frescas se recogen enjuagando los fémures de los ratones, se cortan en secciones transversales de 0,5 mm y se colocan en una cámara de incubación a 37 ° C que contiene un tampón fisiológico. Los megacariocitos se hacen gradualmente visibles en la periferia del explante y se observan hasta 6 horas bajo un microscopio invertido acoplado a una cámara de video. Con el tiempo, los megacariocitos cambian su forma, con algunas células que tienen una forma esférica y otras que desarrollan extensiones gruesas o extienden muchos proplatelets delgados con ramificaciones extensas. Se llevan a cabo investigaciones cualitativas y cuantitativas. Este método tiene la ventaja de ser simple, reproducible y rápido, ya que numerosos megacariocitos están presentes, y clásicamente la mitad de ellos forman proplalets en 6 horas en comparación con 4 días para los megacariocitos de ratón cultivados. Además del estudio de ratones mutantes, una aplicación interesante de este método es la evaluación directa de los agentes farmacológicos en el proceso de extensión del proplatelet, sin interferir con el proceso de diferenciación que puede ocurrir en los cultivos.
Introduction
La técnica de explante de médula ósea fue desarrollada por primera vez por Thiéry y Bessis en 1956 para describir la formación de extensiones citoplasmáticas de megacariocitos de rata como un evento inicial en la formación de plaquetas1. Utilizando contraste de fase y técnicas cinematográficas, estos autores caracterizaron la transformación de megacariocitos redondos maduros en células trombocitogénicas “parecidas a calamares” con extensiones citoplasmáticas que muestran movimientos dinámicos de elongación y contracción. Estos brazos se vuelven progresivamente más delgados hasta que se vuelven filiformes con pequeñas hinchazones a lo largo de los brazos y en las puntas. Estas elongaciones típicas de megacariocitos, obtenidas in vitro y en medios líquidos, tienen ciertas similitudes con las plaquetas observadas en la médula ósea fija, donde los megacariocitos sobresalen largas extensiones a través de las paredes sinusoides en la circulación sanguínea2,3. El descubrimiento y clonación de TPO en 1994, permitió diferenciar megacariocitos en cultivo capaces de formar extensiones proplatletas similares a las descritas en los explantes de médula ósea4,5,6. Sin embargo, la maduración de los megacariocitos es mucho menos eficiente en condiciones de cultivo, en particular la extensa red de membrana interna de los megacariocitos maduros de la médula ósea está subdesarrollada en los megacariocitos cultivados, lo que dificulta los estudios sobre los mecanismos de la biogénesis plaquetaria7,8.
Detallamos aquí el modelo de explante de médula ósea, basado en Thiéry y Bessis, para seguir en tiempo real la formación de proplatlet de megacariocitos de ratón, que han madurado completamente en su entorno nativo, eludiendo así posibles artefactos in vitro y malas interpretaciones. Los resultados obtenidos en ratones adultos de tipo salvaje se presentan para ilustrar la capacidad de los megacariocitos para extender los proplatlets, su morfología y la complejidad de los proplatlets. También introducimos una estrategia de cuantificación rápida para la validación de la calidad para garantizar la precisión y robustez de los datos durante el proceso de registro de megacariocitos. El protocolo aquí presentado es la versión más reciente del método publicado como libro capítulo anteriormente9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí describimos un método in vitro simple y de bajo costo para evaluar la eficiencia de los megacariocitos para extender los proplatlets que han crecido en la médula ósea. El modelo de explante de médula ósea para ratón tiene cuatro ventajas principales. En primer lugar, no se requieren habilidades técnicas avanzadas. En segundo lugar, el tiempo necesario para obtener proplatlets extensibles de megacariocitos es bastante corto, solo 6 horas para el método de explante, en comparación con un mínimo de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert por su asistencia técnica. Este trabajo ha sido apoyado por ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 y ANR-18-CE14-0037.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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