Proplatelet Formation Dynamics av mus färska benmärg explanter
Summary
Här beskriver vi benmärg explant metoden, från prov beredning till mikroskopisk glidanalys, att utvärdera förmågan hos megakaryocyter som har differentierat i sin fysiologiska miljö att bilda proplatelets.
Abstract
Det sista steget i megakaryopoiesis leder till cytoplasmiska förlängningar från mogna megakaryocyter, de så kallade proplateletsna. Mycket har lärts om proplatelet bildas med hjälp av in vitro-differentierademegakaryocyter; Det finns dock allt fler bevis för att konventionella odlingssystem inte troget rekapitulerar differentierings-/mognadsprocessen som sker inuti benmärgen. I detta manuskript presenterar vi en explantmetod som ursprungligen beskrevs 1956 av Thiéry och Bessis för att visualisera megakaryocyter som har mognat i sin ursprungliga miljö, vilket kringgår potentiella artefakter och feltolkningar. Färska benmärgar samlas in genom att spola lårbenen hos möss, skivas i 0,5 mm tvärsnitt och placeras i en inkubationskammare vid 37 °C som innehåller en fysiologisk buffert. Megakaryocyter blir gradvis synliga vid explantens periferi och observeras upp till 6 timmar under ett inverterat mikroskop kopplat till en videokamera. Med tiden ändrar megakaryocyter sin form, med vissa celler som har en sfärisk form och andra utvecklar tjocka förlängningar eller utökar många tunna proplatelets med omfattande förgrening. Både kvalitativa och kvantitativa undersökningar genomförs. Denna metod har fördelen att vara enkel, reproducerbar och snabb som många megakaryocyter är närvarande, och klassiskt hälften av dem bildar proplatelets i 6 timmar jämfört med 4 dagar för odlade mus megakaryocyter. Förutom studien av muterade möss är en intressant tillämpning av denna metod den enkla utvärderingen av farmakologiska medel på proplatelet förlängningsprocessen, utan att störa differentieringsprocessen som kan uppstå i kulturer.
Introduction
Benmärg explant tekniken utvecklades först av Thiéry och Bessis 1956 för att beskriva bildandet av råtta megakaryocyt cytoplasmic förlängningar som en första händelse i trombocyt bildandet1. Med hjälp av faskontrast och cinematographic tekniker karakteriserade dessa författare omvandlingen av mogna runda megakaryocyter till “bläckfiskliknande” trombocytogena celler med cytoplasmiska förlängningar som visar dynamiska rörelser av förlängning och sammandragning. Dessa armar blir gradvis tunnare tills de blir filiform med små svullnader längs armarna och vid spetsarna. Dessa typiska megakaryocytförlängningar, erhållna in vitro och i flytande medier, har vissa likheter med trombocyter som observerats i fast benmärg, där megakaryocyter sticker ut långa förlängningar genom sinusoidväggarna in i blodcirkulationen2,3. Upptäckten och kloningen av TPO 1994, tillåtet att skilja megakaryocyter i kultur som kan bilda proplatelet förlängningar som liknar de som beskrivs i benmärg explanter4,5,6. Megakaryocytmamognad är dock mycket mindre effektiv under odlingsförhållanden, särskilt det omfattande inre membrannätverket av benmärgsmogna megakaryocyter är underutvecklat i odlade megakaryocyter, vilket hindrar studier om mekanismerna för trombocytbiogenes7,8.
Vi beskriver här benmärg explant modellen, baserat på Thiéry och Bessis, att följa i realtid proplatelet bildandet av mus megakaryocyter, som har full mognad i sin inhemska miljö, vilket kringgår möjliga in vitro artefakter och feltolkningar. Resultat erhållna i vilda vuxna möss presenteras för att illustrera megakaryocytens förmåga att förlänga proplatelets, deras morfologi och komplexiteten hos proplatelets. Vi introducerar också en snabb kvantifieringsstrategi för kvalitetsvalidering för att säkerställa datanoggrannhet och robusthet under megakaryocytinspelningsprocessen. Protokollet som presenteras här är den senaste versionen av metoden som publicerades som ett bokkapitel tidigare9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskriver vi en enkel och billig in vitro-metod för att utvärdera effektiviteten hos megakaryocyter för att utöka proplatelets som har vuxit i benmärgen. Benmärg explant modellen för musen har fyra huvudsakliga fördelar. För det första krävs inga avancerade tekniska färdigheter. För det andra är den tid som behövs för att erhålla megakaryocytförlängande proplatelets ganska kort, bara 6 timmar för explantmetoden, jämfört med minst 4 dagar för en konventionell odlingsmetod som börjar f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert för tekniskt stöd. Detta arbete har fått stöd av ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 och ANR-18-CE14-0037.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
