यहां वर्णित सेलुलर निरोधात्मक प्रोटीन एसएएमएचडी 1 द्वारा एचआईवी -1 प्रतिबंध की सीमा निर्धारित करने के लिए एक स्थापित विधि है। मानव माइलॉयड वंश यू 937 कोशिकाओं को एसएएमएचडी 1 अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस किया जाता है, जो वाईएफपी को सह-व्यक्त करता है, विभेदित होता है और फिर एचआईवी-आरएफपी के साथ चुनौती देता है। प्रतिबंध का स्तर प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जाता है।
बाँझ α-आकृति / हिस्टिडाइन-एस्पार्टेट डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एसएएमएचडी 1) क्विसेंट माइलॉयड कोशिकाओं में एचआईवी -1 की प्रतिकृति को रोकता है। यू 937 कोशिकाओं को व्यापक रूप से एसएएमएचडी 1 आरएनए अभिव्यक्ति के निम्न स्तर के कारण एसएएमएचडी 1 गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक सुविधाजनक सेल सिस्टम के रूप में उपयोग किया जाता है, जिससे अज्ञात अंतर्जात प्रोटीन अभिव्यक्ति होती है। अन्य रेट्रोवायरल प्रतिबंध कारकों को चिह्नित करने के लिए स्टोय प्रयोगशाला में विकसित इसी तरह के परख के आधार पर, बिशप लैब ने यू 9 37 कोशिकाओं में एसएएमएचडी 1 का विश्लेषण करने के लिए दो-रंग प्रतिबंध परख विकसित की। एक आईआरईएस से व्यक्त वाईएफपी के साथ एसएएमएचडी 1 को व्यक्त करने वाले मुराइन ल्यूकेमिया वायरस जैसे कणों का उपयोग यू 937 कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को तब फोरबोल मायरिस्टेट एसीटेट के साथ इलाज किया जाता है ताकि एक क्विसेंट फेनोटाइप में भेदभाव को प्रेरित किया जा सके। भेदभाव के बाद, कोशिकाएं एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को व्यक्त करने वाले एचआईवी -1 वायरस जैसे कणों से संक्रमित होती हैं। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा काटा और विश्लेषण किया जाता है। SAMHD1-व्यक्त आबादी में एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं के अनुपात की तुलना आंतरिक नियंत्रण कोशिकाओं में SAMHD1 की कमी से की जाती है। इस तुलना से एक प्रतिबंध अनुपात का पता चलता है। SAMHD1 अभिव्यक्ति एचआईवी संक्रमण में पांच गुना कमी की ओर ले जाती है, जो 0.2 के प्रतिबंध अनुपात के अनुरूप है। एचआईवी संक्रमण के लिए रिपोर्टर जीन के रूप में मूल जीएफपी के लिए आरएफपी के हमारे हालिया प्रतिस्थापन ने फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण की सुविधा प्रदान की है।
इस परख का उपयोग अभिव्यक्ति वेक्टर के साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस से प्राप्त परिवर्तित एसएएमएचडी 1 प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले वायरस के साथ ट्रांसड्यूस करके एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध पर अमीनो एसिड प्रतिस्थापन के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। उदाहरण के लिए, उत्प्रेरक साइट प्रतिस्थापन एचडी 206-7एए 1 का प्रतिबंध फेनोटाइप दिखाता है, जो प्रतिबंध गतिविधि के नुकसान का संकेत देता है। समान रूप से, विभिन्न परीक्षक वायरस की संवेदनशीलता निर्धारित की जा सकती है। परख को एसएएमएचडी 1, सेल चयापचय स्थिति और वायरल प्रतिबंध के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से समझने के लिए भेदभाव की स्थिति, चयापचय स्थिति और एसएएमएचडी 1 संशोधक के प्रभाव को शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
बाँझ α-मोटिफ/हिस्टिडाइन-एस्पार्टेट डोमेन युक्त प्रोटीन 1 (एसएएमएचडी1) माइलॉयड वंश की क्विसेंट कोशिकाओं में मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस टाइप 1 (एचआईवी -1) की प्रतिकृति को बाधित करता है। SAMHD1 एक dNTP ट्राइफॉस्फोहाइड्रोलेस के रूप में अपनी एंजाइमेटिक गतिविधि के माध्यम से प्रतिकृति को अवरुद्ध करता है, जिसके परिणामस्वरूप इंट्रासेल्युलर डीएनटीपी के स्तर में कमी आती है। नतीजतन, एचआईवी -1 रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन की प्रक्रिया को कुशलतापूर्वक नहीं कर सकता है। इस प्रारंभिक अवलोकन के बाद से कुछ वर्षों में बहुत प्रगति हुई है, विशेष रूप से एसएएमएचडी 1 की एंटीवायरल गतिविधि के लिए विशिष्ट डोमेन और अमीनो एसिड के योगदान के बारे में। ये अंतर्दृष्टि जैव रासायनिक परख के साथ-साथ सेल सिस्टम का उपयोग करके बनाई गई है जो शारीरिक रूप से प्रासंगिक क्विसेंट माइलॉयड वातावरण की नकल करती है। यू 937 कोशिकाएं1 व्यापक रूप से SAMHD1 गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक सुविधाजनक माइलॉयड सेल सिस्टम के रूप में उपयोग की जाती हैं। यह अंतर्जात SAMHD1 अभिव्यक्ति की कमी के कारण है, जिसे SAMHD1-व्यक्त कोशिकाओं (चल रहे शोध का एक क्षेत्र) की तुलना में कम आरएनए स्तर के कारण माना जाता है। यहां, प्रोटोकॉल एचआईवी -1 के एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध के तंत्र की जांच करने के लिए वायरस जैसे कणों के साथ यू 937 कोशिकाओं के क्षणिक पारगमन का वर्णन करता है। रेट्रोवायरल प्रतिबंधों की जांच करने के लिए इस तरह के क्षणिक दो-रंग प्रवाह साइटोमेट्री परख पहली बार स्टोय प्रयोगशाला2 में विकसित किए गए थे और तब से त्रिपक्षीय आकृति (टीआरआईएम) प्रोटीन3 सहित अन्य प्रतिबंध कारकों की जांच के लिए अनुकूलित किया गया है। इन परखों से प्रेरित होकर, बिशप लैब ने यू 9 37 कोशिकाओं में एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध का विश्लेषण करने के लिए दो-रंग परख विकसित की।
प्रयोग के लिए वर्कफ़्लो चित्र 1 में दिखाया गया है। मुराइन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी) जैसे कणों में एक आईआरईएस से व्यक्त वाईएफपी के साथ एसएएमएचडी 1 को एन्कोडिंग करने वाला द्वि-सिस्ट्रोनिक संदेश होता है, जिसका उपयोग यू 937 कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को तब फोरबोल मायरिस्टेट एसीटेट (पीएमए) के साथ इलाज किया जाता है ताकि एक क्विसेंट फेनोटाइप में भेदभाव को प्रेरित किया जा सके। कोशिकाएं लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी) व्यक्त करने वाले एचआईवी -1 वायरस जैसे कणों से संक्रमित होती हैं। 48 घंटे के बाद, कोशिकाओं को दो-रंग प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा काटा और विश्लेषण किया जाता है। इस परख का उपयोग वाईएफपी और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ भी किया जाता है, जिसमें फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए कम मानक फिल्टर संयोजन की आवश्यकता होती है। एचआईवी-आरएफपी का उपयोग अधिक सरल मुआवजे की अनुमति देता है और इस प्रकार परख कम अनुभवी प्रवाह साइटोमेट्री उपयोगकर्ताओं के लिए अधिक आसानी से सुलभ है, और अधिकांश साइटोमीटर के साथ प्राप्त करने योग्य है।
विश्लेषण के दौरान, एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं के अनुपात की तुलना SAMHD1-व्यक्त कोशिकाओं और कोशिकाओं के एक ही कुएं के भीतर SAMHD1 की कमी वाले लोगों के बीच की जाती है। यह वेल / फ्लो साइटोमेट्री ट्यूब में एक आंतरिक नियंत्रण प्रदान करता है, जो एक महत्वपूर्ण विशेषता है। ट्रांसड्यूस्ड और अनट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं में संक्रमण के स्तर की तुलना से एक प्रतिबंध अनुपात का पता चलता है। 1.0 का अनुपात इंगित करता है कि ट्रांसड्यूस्ड कारक का संक्रामकता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। जंगली प्रकार एसएएमएचडी 1 अभिव्यक्ति इस परख में एचआईवी संक्रमण में पांच गुना कमी की ओर ले जाती है, जो 0.2 के प्रतिबंध अनुपात के अनुरूप है। हालांकि यह प्रभाव टीआरआईएम 5 जैसे अधिक क्लासिक प्रतिबंध कारकों की तुलना में मामूली है, फिर भी प्रभाव प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और संशोधित एसएएमएचडी 1 एक्सप्रेसर्स के वर्गीकरण की अनुमति देता है जो जंगली प्रकार के प्रोटीन के बराबर तरीके से प्रतिबंधित करते हैं, जो प्रतिबंधित करने में विफल रहते हैं, और जो एक मध्यवर्ती फेनोटाइप वाले हैं।
इस परख का उपयोग एसएएमएचडी 1 डोमेन और एमिनो एसिड उत्परिवर्ती के प्रतिबंध फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, जो उत्परिवर्ती एसएएमएचडी 1 अनुक्रमों को एन्कोडिंग करने वाले वायरस के साथ ट्रांसड्यूस करके है। उदाहरण के लिए, उत्प्रेरक साइट प्रतिस्थापन एचडी 206-7एए इस परख में प्रतिबंधित करने में विफल रहता है। समान रूप से, विभिन्न परीक्षक वायरस की संवेदनशीलता निर्धारित की जा सकती है। उदाहरण के लिए, एचआईवी -1 रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस म्यूटेंट एसएएमएचडी 1-मध्यस्थता प्रतिबंध (जैसे, 151 वी4) के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। यह प्रोटोकॉल वायरस जैसे कण (वीएलपी) उत्पादन, एसएएमएचडी 1 अभिव्यक्ति वैक्टर के साथ यू 937 के पारगमन, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर को ले जाने वाले एचआईवी के साथ संक्रमण और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा बाद के विश्लेषण के विवरण को रेखांकित करता है। यह आलेख चर्चा करता है कि किस डेटा की अपेक्षा करें और उप-मानक परिणामों से कैसे बचें। अंत में, परख के लिए वैकल्पिक उपयोगों को रेखांकित किया गया है, एसएएमएचडी 1, डीएनटीपी स्तरों और वायरल संक्रमण के बीच परस्पर क्रिया को अधिक अच्छी तरह से समझने के लिए विभिन्न एसएएमएचडी 1 वेरिएंट की जांच करने के अलावा। सेल चयापचय के केंद्र में SAMHD1 की भूमिका को देखते हुए, कैंसर के अतिरिक्त लिंक के साथ, यह गहन रुचि का क्षेत्र बना हुआ है।
जैसा कि ऊपर दिए गए नोट्स में चर्चा की गई है, प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलू वीएलपी उत्पादन के लिए सही सेल फेनोटाइप को बनाए रखने और एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध का पालन करने के लिए उपयुक्त वातावरण बनाने के आसपास केंद्रित हैं। सबसे पहले, दो-रंग प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा प्रतिबंध का सटीक विश्लेषण ट्रांसड्यूस्ड और संक्रमित कोशिकाओं के उचित अनुपात को प्राप्त करने पर निर्भर करता है ताकि विश्लेषण के लिए प्लॉट के प्रत्येक क्षेत्र में पर्याप्त कोशिकाएं हों। इस प्रकार शोधकर्ता को 1 से कम के एमओआई के लिए लक्ष्य रखना चाहिए ( प्रोटोकॉल देखें)। पारगमन और संक्रमण दर जो या तो बहुत अधिक या बहुत कम हैं, असंक्रमित या दोगुना संक्रमित कोशिकाओं की कमी के कारण विश्लेषण के साथ समस्याएं पैदा करते हैं। समान रूप से, SAMHD1 वैक्टर की तुलना के लिए एक समान पारगमन दर एक ही मुआवजा मैट्रिक्स की अनुमति देने और पूरे प्रयोग पर लागू करने की अनुमति देने के लिए महत्वपूर्ण है, जिससे बाद के विश्लेषण में विश्वास बढ़ जाता है।
दूसरे, उपयोग की जाने वाली यू 937 कोशिकाओं की उम्र एक महत्वपूर्ण कारक है कि क्या वे सफलतापूर्वक अंतर करते हैं। पालन के अवलोकन के माध्यम से सफल भेदभाव की निगरानी की जा सकती है, भेदभाव के बाद समय के साथ मीडिया का कम अम्लीकरण और परख में जंगली प्रकार के सकारात्मक नियंत्रण द्वारा पर्याप्त प्रतिबंध। 5 दिनों तक का विभेदन सफल रहा है।
इस परख के प्रमुख लाभों में से एक इसका लचीलापन है। एसएएमएचडी 1 (डोमेन, अमीनो एसिड, प्रजाति अनुक्रम) के विभिन्न प्रकार के संशोधित संस्करणों का परीक्षण वेक्टर या क्लोनिंग के सरल साइट-निर्देशित म्यूटेनेसिस के माध्यम से किया जा सकता है। समान रूप से, परीक्षक वायरस के रूपों का पता लगाया जा सकता है। परख का उपयोग पहले यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया है कि डीएनटीपी को बांधने की कम क्षमता वाले एचआईवी -1 रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस म्यूटेंट एसएएमएचडी 1 प्रतिबंध के प्रति अधिक संवेदनशील हैं। SAMHD1 द्वारा अन्य वायरस के प्रतिबंध का परीक्षण करने के लिए एक ही सिद्धांत का उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, इंट्रासेल्युलर डीएनटीपी सांद्रता के अलग-अलग भेदभाव की स्थिति या कृत्रिम हेरफेर का उपयोग इंट्रासेल्युलर स्थितियों और एसएएमएचडी 1 गतिविधि के बीच बातचीत की जांच करने के लिए किया जा सकता है, जो बिशप लैब में सक्रिय अनुसंधान का एक क्षेत्र है। विभिन्न न्यूक्लियोसाइड रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस इनहिबिटर के साथ एसएएमएचडी 1 की बातचीत का भी वर्णन किया गया है, और प्राथमिक कोशिकाओं में उपयोग के लिए संशोधित इस परख का उपयोग करके दिखाए गए एसएएमएचडी 1 के प्रभावको 12,13,14,15।
प्राथमिक कोशिकाओं में उपयोग के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन रूपांतरित कोशिकाओं में चयापचय फेनोटाइप की जांच करके उत्पन्न सीमा को दूर करता है। हालांकि, मौजूदा प्रारूप उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक और कम तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रोटोकॉल की अनुमति देता है, खासकर उच्च-थ्रूपुट सैंपलर के साथ फ्लो साइटोमीटर के उपयोग के साथ। प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय, आंतरिक रूप से अपरिवर्तित कोशिकाओं की संवेदनशीलता को दर्शक प्रभाव (जैसे, प्रतिरक्षा संकेतन) के लिए माना जाना चाहिए।
सेल जीव विज्ञान के कई पहलुओं के साथ, यह आवश्यक है कि इस तरह के परख का उपयोग किसी दिए गए घटना को समझने के लिए समग्र दृष्टिकोण के हिस्से के रूप में किया जाए। SAMHD1 गतिविधि16 के लिए जैव रासायनिक परख का समानांतर उपयोग, इंट्रासेल्युलर dNTP पूल का परिमाणीकरण, और मनुष्यों, पूर्व विवो और पशु मॉडल में SAMHD1 उत्परिवर्ती फेनोटाइप का अवलोकन (दुनिया भर की प्रयोगशालाओं द्वारा किया जा रहा है, कुछ इस मुद्दे में वर्णित हैं) इस जटिल प्रोटीन की विकसित समझ के लिए महत्वपूर्ण हैं।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को फ्रांसिस क्रिक इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित किया गया था, जो कैंसर रिसर्च यूके (एफसी001042 और एफसी001162), यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एफसी001042 और एफसी001162), और वेलकम ट्रस्ट (एफसी001042 और एफसी001162) और जेपीएस (108012 / जेड / जेड / जेड) के लिए वेलकम ट्रस्ट इन्वेस्टिगेटर अवार्ड द्वारा अपना मुख्य वित्त पोषण प्राप्त करता है। कैम्ब्रिज विश्वविद्यालय में काम एनआईएचआर कैम्ब्रिज बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर, द एवलिन ट्रस्ट (16/21), द रोजट्रीज ट्रस्ट (एम 590), और यूके मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एमआर / एस 009752/1) द्वारा सह-वित्त पोषित था। बाद में यूके वित्त पोषित पुरस्कार यूरोपीय संघ द्वारा समर्थित ईडीसीटीपी 2 कार्यक्रम का हिस्सा है।
293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks – see transfection reagent guidance |
12 well plates | Greiner | 665180 | |
24 well plates | Greiner | 662160 | |
BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
Flowjo | BD Bioscience | – | alternative analysis software can be used |
light microscope | – | – | Any bright field light microscope |
p8.91 | – | – | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
PBS | Sigma | D8537 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
polybrene | Sigma | TR-1003 | |
pKB4 | – | – | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
pLGatewaySAMHD1eYFP | – | – | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
– | – | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
Prism | Graphpad | – | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
pVSV-G | – | – | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
SCRPSY | – | – | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |