Baculovirus uttryck vektorsystem (BEVS) är en robust plattform för uttryck screening och produktion av protein arginin metyltransferaser (PRMTs) som ska användas för biokemiska, biofysiska och strukturella studier. Milligram mängder material kan produceras för de flesta PRMTs och andra proteiner av intresse som kräver en eukaryotic uttryck plattform.
Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på en mängd olika proteiner som spelar roller i många cellulära processer. PRMTs kan antingen mono- eller dimetylate arginin guanidino grupper symmetriskt eller asymmetriskt. Enzymologin hos dessa proteiner är ett komplext och intensivt undersökt område som kräver milligram mängder högkvalitativt rekombinant protein. Baculovirus uttryck vektorsystem (BEVS) använder Autographa californica flera nukleopolyhedrovirus (AcMNPV) och Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insektsceller har använts för uttryck screening och produktion av många PRMTs, inklusive PRMT 1, 2 och 4 till 9. För att samtidigt screena för uttryck av flera konstruktioner av dessa proteiner, inklusive domäner och trunkerade fragment samt fulllängdsproteiner, har vi tillämpat skalbara metoder som använder justerbara och programmerbara flerkanalspipetter, kombinerat med 24- och 96-brunnsplattor och block. Sammantaget möjliggjorde dessa metodjusteringar en storskalig generation av bacmid-DNA, rekombinanta virus och proteinuttrycksscreening. Att använda kulturkärl med en hög fyllningsvolym av Sf9-cellfjädring hjälpte till att övervinna utrymmesbegränsningar i produktionspipelinen för storskalig proteinproduktion med en sats. Här beskriver vi detaljerade protokoll för effektiva och kostnadseffektiva uttryck av funktionella PRMTs för biokemiska, biofysiska och strukturella studier.
Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på monometyl eller symmetriskt/asymmetriskt dimetyl sätt. De repetitiva RG/ RGG / GRG-sekvenserna är mycket föredragna av de flesta PRMTs och finns i en mängd olikaproteiner 1,2. Arginin metylerade proteiner såsom histoner eller transkriptionsfaktorer och splitsfaktorer reglerar transkription, skarvning och kromatinstruktur3,4. Ökande kunskap om olika regleringar av substrat och kofaktorutnyttjande, omsättning och kinetik hos PRMTs, liksom generering av selektiva hämmare, har kastat mekanistiskt ljus på dessa enzymer och deras komplex5,6. Emellertid studeras inte alla PRMT-familjemedlemmar i samma utsträckning; Till exempel upptäcktes PRMT9 först nyligen vara medlem i PRMT-familjen1. Struktur- och enzymfunktionsstudier för dessa proteiner kräver tillräckliga, ofta milligram, mängder rekombinant protein för att vara tillgängliga.
Escherichia coli (E. coli) prokaryota uttryckssystem är vanligtvis förstahandsvalet för uttrycksscreening med hjälp av flera konstruktioner för ett givet protein7,8,9. E. coli-baseradeuttryck resulterar dock inte alltid i tillräckliga mängder PRMT-proteiner i sina aktiva former, vilket vi särskilt har noterat för PRMT5 och PRMT7 (se nedan). Prmts som inte uttryckte sig i E. coli eller behövde produceras av eukaryota uttrycksmaskiner var således instubberade i vektorer som var lämpliga för uttrycksscreening i det alternativa baculovirusuttrycksvektorsystemet (BEVS). Medan E. coli uttryckte prover av PRMT1, PRMT3 och PRMT8 har använts i stor utsträckning för in vitro-analyser och kristallografi, kräver andra PRMTs såsom PRMT5, som kräver parlamentsledamot50 bindande partner för sin dubbla metyltransferasdomän, och PRMTs som PRMT7 och 9, insektscelluttryck för att erhålla tillräckliga mängder aktivt protein. Sammantaget har de standardiserade metyltransferasanalyserna för MEDELGENOMSTRÖMNING för PRMT4, 5, 6, 7 och 9 använt BEVS i insektsceller6. Baculovirus uttryck vektorsystem (BEVS) är en mångsidig plattform för att producera rekombinanta proteiner som kräver eukaryota uttryck maskiner som möjliggör post-translationella modifieringar väsentliga för biokemiska, biofysiska och strukturella studier10,11,12. Flera BEVSs har blivit kommersiellt tillgängliga sedan den första rapporterade användningen av baculovirus 1983 för proteinuttryck13. De flesta av dessa protokoll använder olika strategier för överföring av uttrycket plasmid till insektsceller. Dessa inkluderar Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Vårt protokoll är baserat på det vanligaste systemet i BEVS, Bac-to-Bac-systemet14, som är utformat för att överföra genen / cDNA kodning av proteinet av intresse (POI, här PRMTs) till baculovirusgenomet som upprätthålls i en specialiserad stam av E. coli via platsspecifikt införlivande15.
Kortfattat omvandlades plasmid överföring vektor som innehåller genen av intresse till DH10Bac E. coli kompetenta celler för att generera rekombinant viral bacmid DNA. Vidhäftande Sf9 celler var sedan transfected med bacmid DNA. Fyra till fem dagar efter transfection, första rekombinanta baculovirus utsöndras i cell kultur medium återfanns och märkts som P1 virus. P1 baculovirus lager användes sedan för virusförstärkning (dvs generation av P2 baculovirus lager) och protein uttryck screening. Baserat på uttrycket screening resultat identifierades P2 virus för bästa uttryck konstruktion av proteinet och används för att generera suspension kulturer av baculovirus-infekterade insekt celler (SCBIIS) för storskalig protein produktion. Här beskriver vi våra detaljerade protokoll och beskriver logiken bakom våra reagens- och kulturkärlsval för att stödja vår strategi att utveckla en mer tidseffektiv, kostnadseffektiv och skalbar metodik för att få tillräckliga mängder önskade rekombinanta proteiner.
En av fördelarna med BEVS i insektsceller är förmågan hos maskinerna för postöversättningsmodifiering för att möjliggöra mer komplexa modifieringar som fosforylering, myristoylering och glykosylering. Tillsammans med den mycket effektiva vikningen av däggdjursproteiner underlättar dessa modifieringar stora mängder modifierat och vikt protein som lämpar sig för fysiologiskt relevanta nedströmsexperiment16.
Här beskrev vi detaljerade protokoll av BEVS betonar kritiska element för framgångsrik uttryck screening av flera konstruktioner av PRMT proteiner och storskalig PRMT proteinproduktion i Baculovirus uttryck plattform: 1) Användningen av regelbundna, justerbara och programmerbara flerkanaliga pipetter för att överföra de biologiska materialen mellan 24- och 96 – väl cell kulturplattor och block i stadierna av bacmid DNA och virus generation; En samling rekombinanta virus, förstärkning av virusvolymer av rekombinanta virus och beredning av proteinuttrycksscreeningsblocken. 2) Högpresterande och kostnadseffektiva transfection reagenser för generering av rekombinanta virus. 3) Suspensionskultur av baculovirusinfekterade insektsceller (SCBIIC) för storskalig proteinproduktion. 4) Användning av högfyllningsvolym 2,8 L Fernbachskakflaskor för att upprätthålla Sf9-suspensionskulturen och 2,5 L Tunair-skakflaskor och 5 L reagensflaskor för storskalig proteinproduktion.
Särskilda överväganden och motiveringar för omvandlings- och transfection-stegen.
Även om ett kommersiellt protokoll rekommenderar att man använder 100 μL kompetenta celler för en omvandling14,är omvandlingseffektiviteten hos kommersiella DH10Bac E. coli-kompetenta celler så hög som 1 x 108 cfu / μg DNA, så vi använder bara 4 μL. Detta är tillräckligt för varje transformant för att få isolerade vita rekombinanta kolonier för bacmid DNA-isoleringen. Vidhäftande Sf9 celler i 24-brunn transfection plattan såddes med en celltäthet på 2 x 105 /mL i 0,5 mL serumfria insektsmedier. Denna volym är tillräcklig för att säkerställa jämn täckning av brunnens arbetsyta. Samtidigt späder det inte ut transfectionblandningen för mycket, vilket förbättrar transfectioneffektiviteten. Transfection reagenser är giftfria för Sf9-cellerna, och medieutbyte är inte nödvändigt. I stället för en medieändring tillsätts ytterligare 1,5 ml media som innehåller 10 % (v/v) FBS i transfektionsplattan vid 4-5 timmar efter transfection-tid för att underlätta celltillväxt. Transfection effektiviteten hos båda transfection reagenser är hög. Ändå, med X-tremeGene 9, visas tecknen på infektion i de transfekterade cellerna (figur 2) 10-12 h tidigare än med JetPrime reagens, så vi väljer mellan dessa reagenser beroende på arbetsschemat för nästa steg i protokollen, vilket ger viss flexibilitet i den övergripande processen.
Screening av proteintestuttryck kan ställas in med P2-virus om mängden av de ursprungliga rekombinanta virusen, som samlats in från transfektplattan och märkts som P1, är en begränsande faktor att använda för proteinuttrycksscreeningen.
Överväganden när man går från små till stora kulturvolymer.
Historiskt sett trodde man att optimal celltillväxt kräver ett högt luftutrymme i upphängningskulturen av Sf9-cellunderhåll och uppskalning av produktioner. Men 2014 rapporterades det att högt luftrum i kulturfartyg är mindre kritiskt än man tidigare trott17. Ett kulturkärl som inrättats med hjälp av lämpligt justerad skakningshastighet till skakplattformens omloppskastning kommer att ge tillräcklig syreöverföring även i högfyllningsvolymupphängningskulturen genom att skapa och underhålla små luftbubblor under en längre tid. Med detta tillvägagångssätt kan kommersiellt tillgängliga insektsceller odlas med en högre skakningshastighet inom ett normalt intervall av cellernas fördubblingstid utan att offra hög cell livskraft.
För sex år sedan började vi alltså öka upphängningskulturen i en skakkolv under cellunderhållet och införde en annan typ av odlingskärl för proteinproduktion samtidigt som vi justerade och övervakade skakningsförhållandena (figur 6). För att fastställa optimala förhållanden i dessa odlingskärl övervakade vi Sf9-cellkulturparametrarna som celldubblingstid tillsammans med cellens livskraft, storlek och form, aggregeringstillstånd och cellernas smittsamhet.
Till exempel, för Sf9-cellunderhåll, i 2,8 L Fernbach-skakkolverna, odlar vi 2 L istället för 0,8 L av Sf9-suspensionscellerna som skakar vid 150 varv/min vid 27 °C och cellens livskraft är för det mesta nära 99%, med jämnt formade friska delningsceller. För uppskalning av produktionen infekterar vi 4 L celler i 5 L reagensflaskor som skakar i hög hastighet som 145 varv/min vid en sänkt temperatur på 25 °C. De vanligaste inkubatorerna med inbyggd skakplattform kan rymma 6 x 2,8 L skakflaskor eller 6 x 5 L reagensflaskor, eller 10 x 2,5 L Tunair shake-flaskor. Således är kapaciteten hos den enda skakplattformen, om vi fyller Fernbachs skakflaskor och reagensflaskor till 1/3 jämfört med kärlens höga fyllningsvolym, 4,8 L jämfört med 12 L med hjälp av 2,8 L Fernbach skakflaskor och 10 L mot 24 L med 5 L reagensflaskor (Figur 6). Underhåll av suspensionsceller och uppskalning av produktionen i kulturkärlen med hög fyllvolym har hjälpt oss att övervinna begränsningarna i produktionsvolymerna och anta en storskalig plattform. Detta är därför mycket användbart för laboratorier utan tillgång till bioreaktorer och/eller begränsat utrymme i produktionspipelinerna.
Detta protokoll skulle lätt kunna anpassas för produktion och rening av proteinkonstruktioner med olika affinitetstaggar genom att använda lämpliga hartser och modifiera reningsbuffertar som har beskrivits i SGC publiceradi kapitel 6 för de flaggmärkta fullängdsproteinerna PRMT4, 7, 9 och det hansmärkta PRMT5-MEP50-komplexet och PRMT6. Även om vi beskriver ett BEVS-protokoll för PRMT-familjen av proteiner, kan samma tillvägagångssätt tillämpas på alla andra proteinfamiljer.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dalia Barsyte-Lovejoy för att ha tagit sig tid att ge värdefull feedback och kritiska kommentarer om manuskriptet och alla våra SGC-kollegor som arbetade med PRMT-proteinfamiljen uttryckt från Baculovirus Expression Vector System.
SGC är en registrerad välgörenhetsorganisation (nummer 1097737) som får medel från AbbVie, Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Genentech, Genome Canada genom Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU och EFPIA genom det gemensamma företaget Innovative Medicines Initiative 2 [EUbOPEN grant 875510], Janssen, Merck KGaA (även känd som EMD i Kanada och USA), Pfizer, Takeda och Wellcome Trust [106169/ZZ14/Z].
2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
Beckman JLA 8.1000 | |||
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |