Produktion av rekombinanta PRMT-proteiner med baculovirusuttrycksvektorsystemet

Summary

Baculovirus uttryck vektorsystem (BEVS) är en robust plattform för uttryck screening och produktion av protein arginin metyltransferaser (PRMTs) som ska användas för biokemiska, biofysiska och strukturella studier. Milligram mängder material kan produceras för de flesta PRMTs och andra proteiner av intresse som kräver en eukaryotic uttryck plattform.

Abstract

Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på en mängd olika proteiner som spelar roller i många cellulära processer. PRMTs kan antingen mono- eller dimetylate arginin guanidino grupper symmetriskt eller asymmetriskt. Enzymologin hos dessa proteiner är ett komplext och intensivt undersökt område som kräver milligram mängder högkvalitativt rekombinant protein. Baculovirus uttryck vektorsystem (BEVS) använder Autographa californica flera nukleopolyhedrovirus (AcMNPV) och Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) insektsceller har använts för uttryck screening och produktion av många PRMTs, inklusive PRMT 1, 2 och 4 till 9. För att samtidigt screena för uttryck av flera konstruktioner av dessa proteiner, inklusive domäner och trunkerade fragment samt fulllängdsproteiner, har vi tillämpat skalbara metoder som använder justerbara och programmerbara flerkanalspipetter, kombinerat med 24- och 96-brunnsplattor och block. Sammantaget möjliggjorde dessa metodjusteringar en storskalig generation av bacmid-DNA, rekombinanta virus och proteinuttrycksscreening. Att använda kulturkärl med en hög fyllningsvolym av Sf9-cellfjädring hjälpte till att övervinna utrymmesbegränsningar i produktionspipelinen för storskalig proteinproduktion med en sats. Här beskriver vi detaljerade protokoll för effektiva och kostnadseffektiva uttryck av funktionella PRMTs för biokemiska, biofysiska och strukturella studier.

Introduction

Protein arginin metyltransferaser (PRMTs) metylat argininrester på monometyl eller symmetriskt/asymmetriskt dimetyl sätt. De repetitiva RG/ RGG / GRG-sekvenserna är mycket föredragna av de flesta PRMTs och finns i en mängd olika^{proteiner 1,2}. Arginin metylerade proteiner såsom histoner eller transkriptionsfaktorer och splitsfaktorer reglerar transkription, skarvning och kromatinstruktur^3,4. Ökande kunskap om olika regleringar av substrat och kofaktorutnyttjande, omsättning och kinetik hos PRMTs, liksom generering av selektiva hämmare, har kastat mekanistiskt ljus på dessa enzymer och deras komplex^5,6. Emellertid studeras inte alla PRMT-familjemedlemmar i samma utsträckning; Till exempel upptäcktes PRMT9 först nyligen vara medlem i PRMT-familjen¹. Struktur- och enzymfunktionsstudier för dessa proteiner kräver tillräckliga, ofta milligram, mängder rekombinant protein för att vara tillgängliga.

Escherichia coli (E. coli) prokaryota uttryckssystem är vanligtvis förstahandsvalet för uttrycksscreening med hjälp av flera konstruktioner för ett givet protein^7,8,9. E. coli-baseradeuttryck resulterar dock inte alltid i tillräckliga mängder PRMT-proteiner i sina aktiva former, vilket vi särskilt har noterat för PRMT5 och PRMT7 (se nedan). Prmts som inte uttryckte sig i E. coli eller behövde produceras av eukaryota uttrycksmaskiner var således instubberade i vektorer som var lämpliga för uttrycksscreening i det alternativa baculovirusuttrycksvektorsystemet (BEVS). Medan E. coli uttryckte prover av PRMT1, PRMT3 och PRMT8 har använts i stor utsträckning för in vitro-analyser och kristallografi, kräver andra PRMTs såsom PRMT5, som kräver parlamentsledamot50 bindande partner för sin dubbla metyltransferasdomän, och PRMTs som PRMT7 och 9, insektscelluttryck för att erhålla tillräckliga mängder aktivt protein. Sammantaget har de standardiserade metyltransferasanalyserna för MEDELGENOMSTRÖMNING för PRMT4, 5, 6, 7 och 9 använt BEVS i insektsceller⁶. Baculovirus uttryck vektorsystem (BEVS) är en mångsidig plattform för att producera rekombinanta proteiner som kräver eukaryota uttryck maskiner som möjliggör post-translationella modifieringar väsentliga för biokemiska, biofysiska och strukturella studier^10,11,12. Flera BEVSs har blivit kommersiellt tillgängliga sedan den första rapporterade användningen av baculovirus 1983 för proteinuttryck¹³. De flesta av dessa protokoll använder olika strategier för överföring av uttrycket plasmid till insektsceller. Dessa inkluderar Bac-to-Bac, flashBAC, BaculoGOLD Bright, BacVector-3000, BacMagic, BacPAK, etc. Vårt protokoll är baserat på det vanligaste systemet i BEVS, Bac-to-Bac-systemet¹⁴, som är utformat för att överföra genen / cDNA kodning av proteinet av intresse (POI, här PRMTs) till baculovirusgenomet som upprätthålls i en specialiserad stam av E. coli via platsspecifikt införlivande¹⁵.

Kortfattat omvandlades plasmid överföring vektor som innehåller genen av intresse till DH10Bac E. coli kompetenta celler för att generera rekombinant viral bacmid DNA. Vidhäftande Sf9 celler var sedan transfected med bacmid DNA. Fyra till fem dagar efter transfection, första rekombinanta baculovirus utsöndras i cell kultur medium återfanns och märkts som P1 virus. P1 baculovirus lager användes sedan för virusförstärkning (dvs generation av P2 baculovirus lager) och protein uttryck screening. Baserat på uttrycket screening resultat identifierades P2 virus för bästa uttryck konstruktion av proteinet och används för att generera suspension kulturer av baculovirus-infekterade insekt celler (SCBIIS) för storskalig protein produktion. Här beskriver vi våra detaljerade protokoll och beskriver logiken bakom våra reagens- och kulturkärlsval för att stödja vår strategi att utveckla en mer tidseffektiv, kostnadseffektiv och skalbar metodik för att få tillräckliga mängder önskade rekombinanta proteiner.

Protocol

Översikten över BEVS-protokollstegen beskrivs i figur 1. 1. Generering av ett rekombinant bacmid-DNA Förberedelse av LB agar selektiva plattor för DH10Bac omvandling Förbered LB-agarplattor som innehåller: 50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin, 10 μg/mL tetracyklin, 200 μg/mL Bluo-gal och 40 μg/mL IPTG att välja för DH10Bac transformantia. Väg 25 g förblandad LB-buljong och 13 g Bacto Agar och lägg i 2 L-kolv. För volymen till 1 L med destillerat vatten och autoklav i 15-30 min vid 121 °C. Ställ in ett vattenbad vid 50 °C och kyl den autoklaverade agarlösningen i vattenbadet i 40-60 min tills den kyls ner till 50-55 °C. Tillsätt gentamicin till en slutlig koncentration på 7 μg/ml, kanamycin till en slutlig koncentration på 50 μg/ml, tetracyklin till en slutlig koncentration på 10 μg/ml, Bluo-gal till en slutlig koncentration på 200 μg/ml och IPTG till en slutlig koncentration på 40 μg/ml. Blanda agarlösningen och alikvoten 7-10 ml av mediet till varje 60 mm platta med en 50 ml pipett. Låt plattorna sitta i rumstemperatur (2 h) för att härda. Vänd, linda och förvara vid 4 °C. Plattor som innehåller antibiotika är stabila i upp till 4 veckor. Omvandling av plasmiden till DH10Bac E. coli kompetenta celler Beräkna den önskade volymen av kompetenta celler. Tina kompetenta celler på is, snurra försiktigt ner och återanvänd tillbaka genom skonsam gängning. Använd en 12-kanals pipett för att dela ut 4 μL av cellerna i varje brunn på 96-brunns PCR-plattan. Tillsätt ~ 0,3-0,5 μg rekombinant plasmid-DNA till de kompetenta cellerna och blanda försiktigt genom att knacka. Inkubera blandningen på is i 10-15 min. Värmechocka blandningen i en PCR-maskin vid 42 °C i 45 s. Kyl på isen i 2 minuter. Dispensera 0,5 ml SOC-medium till varje brunn i de 96-brunnsblocken (96-djup brunn 2,4 ml). Använd en 12-kanals pipett för att överföra den omvandlade bakteriesuspensionen till motsvarande brunn i blocket och täcka den med ett luftrör. Placera blocket i en skakande inkubator vid 37 °C med medelhög omrörning (205 varv/min) i 4-5 timmar. Sprid 30-50 μL av kulturen jämnt över ytan på LB-agarplattan med sterila glaspärlor. Förvara resten av kulturen vid 4 °C. Inkubera plattorna vid 37 °C tills färgen på de blå/vita kolonierna kan urskiljas (40-48 h). Kassera kulturen när tillräckligt med vita, stora kolonier erhålls på plattan. För att säkerställa att vita kolonier endast innehåller rekombinant bacmid-DNA, re-streak en isolerad vit koloni på färska LB agar plattor som innehåller antibiotika, bluo-gal och IPTG för att verifiera fenotyp. Inkubera i 48 timmar vid 37 °C. Välj en verifierad vit koloni från en omstrimerad tallrik för extraktion av rekombinant bacmid DNA. Isolera rekombinant bacmid DNA Inokulera en enda, isolerad vit koloni till 3 ml LB-medium kompletterat med 50 μg/mL kanamycin, 7 μg/ml gentamicin och 10 μg/mL tetracyklin i 24-brunnsblock (24-brunnsblock runt botten) och täck med en airpore-ark. Odla vid 37 °C över natten med skakningar vid 250 varv/min. Centrifugera 24-brunnsblocken på 2 100 x g i 10 minuter. Dekantera supernaten, vänd blocket och knacka försiktigt på ett absorberande vävnadspapper. Tillsätt 250 μL lösning 1 (cellresuspensionslösning) till varje brunn. Försegla blocken med tejpkuddar eller andra tätningsfilmer och placera dem på en skakplattform vid 75 varv/min i 5-10 min. Kontrollera varje brunn för att säkerställa korrekt celllys och återanvänd vid behov med en 1 ml spets. Tillsätt 250 μL lösning 2 (celllyslösning) till varje brunn, försegla blocken och placera på en skakplattform vid 75 varv/min i 30 s (för att undvika korskontaminering av proverna, vänd inte in 24-brunnsblock) som inkuberar vid rumstemperatur i 4 minuter. Tillsätt 250 μL lösning 3 (neutraliseringslösning), täta blocken och placera på skakplattformen vid 75 varv/min i 30 s. En tjock vit fällning av protein och E. coli genomiskt DNA kommer att bildas. Placera provet på is i 10-15 min. Centrifugera i 60 min vid 2 100 x g vid 4 °C för att tätt pelleta det vita fällmaterialet. Under centrifugering, märk ett nytt mikrocentrifugrör och tillsätt 0,8 ml absolut isopropanol. Överför försiktigt supernatanten till röret som innehåller isopropanol och undvik vitt fällmaterial. Blanda genom att försiktigt vända röret några gånger och lägg sedan på is i 5 till 10 minuter. I detta skede kan provet förvaras vid -20 °C över natten. Centrifuga provet i 15 minuter vid 14 000 x g vid 4 °C. Ta bort supernatanten och tillsätt 0,5 ml 70% etanol till varje rör. Vänd röret flera gånger för att tvätta pelleten. Centrifugera i 5 min vid 14 000 x g vid rumstemperatur. (Valfritt: upprepa tvätt) Ta med prover inuti laminär flödeshuv för att säkerställa plasmidpreparatets sterilitet och ta bort så mycket av supernaten som möjligt.OBS: Pelleten kan lossna från botten av röret, så titta noga på pelleten när du kasserar supernaten. Lufttorka pelleten inuti laminär flödeshuv i 15- 20 min och lös upp DNA i 50 μL filtrerad elueringsbuffert, 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 (se till att pelletsen inte är övertorkade). Eftersom rekombinant bacmid DNA är större än 135 kb i storlek, för att undvika shearing av DNA, lösa upp pelleten genom mild tappning. För att verifiera förekomsten av genen av intresse för bacmid DNA, ställ in PCR reaktionsblandningen i en 96-brunn PCR-platta. Förbered PCR-blandningen enligt följande: 1 μL buffert, 0,2 μL (10 mM vardera) dNTP, 0,1 μL Taq DNA-polymeras, 0,1 μL (25 μM) framåt- och omvänd primers (BACV2FWD: tattccggattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL bacmid-DNA och 8 μL vatten. Utför förstärkning av målgenerna med initial denaturering i 2 min vid 95 °C, följt av 25 cykler på 94 °C för 30 s, 55 °C för 30 s och 72 °C i 1 min/kb. Avsluta reaktionen efter en slutlig förlängning i 7 min vid 72 °C. Analysera 10 μL av förstärkarprodukten på 1% (w/v) agarosgel som innehåller nukleinsyrafärgningslösning med elektrofores. Förvara de verifierade bacmid-DNA vid 4 °C. 2. Generering av rekombinanta baculoviruslager OBS: Använd exponentiellt växande Sf9-celler med en livskraft på 95% eller mer för något steg i baculovirusuttrycksprotokollet, inklusive celltransfektion för baculovirusgenerering, baculovirusvolymförstärkning, proteinuttrycksscreening och proteinproduktion. Transfection av Sf9 celler med Bacmid DNA och transfection reagenser (T.R.) såsom JetPrime eller X-tremeGENE 9.OBS: Trypan Blå färgning och en hemocytometer kan användas för att bestämma livskraftiga cellantal och % cellens livskraft. Icke-livskraftiga celler tar upp fläcken och verkar blå under mikroskopet medan livskraftiga celler förblir osedd. För att beräkna cellens livskraft erhålls ett totalt cellantal (obefläckat och färgat) och det livskraftiga cellantalet divideras med det totala cellantalet och multipliceras med 100. Späd ut de exponentiellt växande Sf9-cellerna till en slutlig celltäthet på 4 x 105 celler/ml i serumfria insektsmedier och häll i den sterila reagensbehållaren. Använd en programmerbar flerkanalspipett för att så 0,5 ml av de utspädda Sf9-cellerna i varje brunn på en 24-brunnsplatta. Märk en brunn på plattan som en kontroll (ej överförd) och använd den som en kontroll för att jämföra de transfekterade och icke-transfekterade cellerna för att bedöma eventuella tecken på infektioner. Efter sådd av cellerna i plattorna, vagga försiktigt plattorna fram och tillbaka flera gånger för att säkerställa ett jämnt monoskikt av celler. Snurra inte plattorna eftersom cellerna kommer att kluster i mitten av brunnen. Inkubera plattorna vid 27 °C i minst 1 timme för att möjliggöra celltillsats på odlingsplattorna. Blanda väl transfection reagensflaskan. För varje transfekt tillsätt 2 μL av transfectionreagenset till 100 μL av transfectionbufferten. Alla andra oupplevda insektsmedium kan också användas. Deponera det utspädda transfectionreagenset i en steril reagensbehållare och blanda försiktigt i 10 s. Använd en 12-kanals pipett och överför 102 μL av det utspädda transfectionreagenset till en steril 96-mikrobrunnsplatta. Överför 10 μL av en 0,2 μg/μL-lösning av rekombinant bacmid-DNA till motsvarande brunn på en 96-brunns mikrobrunnsplatta och blanda genom att försiktigt skaka (knacka) plattan från sidorna. Inkubera transfectionblandningen i 15-20 minuter för att möjliggöra komplex bildning. Använd en justerbar 6-kanals pipett avsedd för överföring mellan 96- och 24-brunnsplattor, tillsätt transfectionblandningen på cellerna droppvis i motsvarande brunnar av transfectionplattor och inkubera i 4-5 h vid 27 °C. Gunga försiktigt plattorna fram och tillbaka flera gånger under inkubationstiden för att säkerställa en jämn fördelning av transfectionblandningen över cellmonalayern. 4-5 h efter transfection, tillsätt 1,5 ml insektsserumfritt medium kompletterat med 10% (v/v) slutligt värmeinaktiverat fetalt bovint serum och antibiotiskt antimykotiskt till 1% (v/v) slutlig volym (100 enheter/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin och 0,25 μg/ml amphotericin B). Inkubera cellerna i en inkubator på 27 °C i 72-96 timmar. Gunga försiktigt transfectionplattorna en gång om dagen när det är möjligt. Leta efter tecken på infektion (SOI), uppenbart i transfekterade celler vid 72-96 h post-transfection (Figur 2). Tänk på att de transfekterade cellerna kommer att börja producera viruset och ytterligare infektera kulturen; således leta efter tecken på infektion.OBS: Tecken på infektion är strukturella förändringar i insektscellerna, såsom en 25-50% ökning av celldiametern, förstorade cellkärnor, jämnt rundad form, förlust av spridning och vidhäftning av odlingsskålens yta, samt en minskning av cellens livskraft (Figur 2. Baculovirus Infekterade och oinfekterade Sf9 celler). 3. Småskalig screening av proteinuttryck och virusförstärkning Infektion av Sf9 celler med P1 baculovirus lager.OBS: 4-5 dagar efter transfektionen ska tecken på infektion vara tydliga i de transfekterade cellerna jämfört med kontrollcellerna (oövervakade) under ett inverterat mikroskop. De första rekombinanta baculovirusen som utsöndras i cellkulturmediet bör vara redo att samla in. Frö 2 x 105 exponentiellt växande Sf9-celler i serumfria insektsmedier i varje brunn av 24-brunnsplattorna i en total volym av 2 ml för infektion med P1-virus för att förstärka virusvolymen (vilket resulterar i generering av P2-virusen). Efter att ha rört cellerna i plattorna, gunga försiktigt plattorna, använd fram och tillbaka rörelse för att säkerställa ett jämnt monoskikt. Snurra inte plattorna eftersom cellerna kommer att kluster i mitten av brunnen. Inkubera plattorna vid 27 °C i minst 1 timme för att möjliggöra cellulär vidhäftning på plattan. Dispensera 4 ml Sf9-celler med en densitet på 3,5-4 x 106 i insektsserumfritt medium i varje brunn med 24-brunnsblock för att infektera med P1-virus för proteinuttrycksscreening.OBS: Märk en brunn på 24-brunnsplattorna och 24-brunnsblocken som kontroll och användning som en oinfekterad kontroll för jämförelse av infekterade och icke-infekterade celler när man letar efter SOI. Använd en programmerbar elektronisk flerkanal för att möjliggöra samtidig insamling av P1-virus (steg 2.1.13), infektion av nysådda Sf9-celler (steg 3.1.1) och infektion av suspensionscellerna i 24-brunnsblocken (steg 3.1.4) med 150 μL P1-virus. Snurra ner resten av de insamlade P1-viruslagren i 15 min vid 17 970 x g, överför dem till mikrocentrifugrör och förvara i mörkret vid 4 °C. Vagga försiktigt 24-brunnsplattorna (steg 3.1.1) på en fram- och återgående skakapparat för att säkerställa en jämn fördelning av de tillagda P1-virusen över cellmonalayern; upprepa detta några gånger under inkubationstiden. Täck 24-brunnsblocken med upphängningskulturen hos infekterade Sf9-celler (steg 3.1.4) med ett luftsporeark. Inkubera 24-brunnsblocken vid 27 °C och skaka vid 245 varv/min i 72-96 timmar. Leta efter SOI inom 72-96 h efter infektionstid i 24-brunnsplattorna med P2-virus (steg 3.1.1) och i 24-brunnsblocken (steg 3.1.4) med infekterade celler för uttrycksscreening.OBS: 4-5 dagar efter infektion av Sf9-celler med P1-virus ska SOI vara tydligt i de infekterade cellerna jämfört med de icke-infekterade kontrollcellerna under ett inverterat mikroskop. Samla P2-virus från 24-brunnsplattor, centrifug i 15 min vid 17 970 x g, överför dem till mikrocentrifugrör och förvara i mörkret vid 4 °C. Vid 72-96 h efter infektion, spraya över 24-brunnsblocken med 70% etanol, ta in i laminär flödeshuv och kontrollera celltätheten och livskraften i några brunnar genom Trypan Blue-färgning. Fortsätt till proteinrening om cellerna har tecken på infektion och livskraften är nära 70-75% enligt trypanblå färgning. Pellet cellerna genom att centrifugera 24-brunnsblocken vid 525 x g vid 4 °C i 15 min. Kassera supernaten och suspendera pelletsen ordentligt i 1 ml lysbuffert bestående av 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM imidazol, 5% glycerol (v/v) och 1x proteashämmarcocktail (100x proteashämmarcocktail består av aprotinin 0,25 mg/mL, leupeptin 0, 25 mg/mL, pepstatin A 0,25 mg/ml; E-64 0,25 mg/ml). Förvara cellfjädringen vid -80 °C för efterföljande provningsrening (se 3.2.2). Protein rening från frysta cell suspension i 24-brunn test-uttryck block. Montering av bindningsblocket (figur 3). Placera 3 överlappande lager parafilm på toppen av det 96 djupa brunnsblocket (96-djup brunn 2,4 ml). Placera en 96-brunns filterplatta (filtermikroplatta, 96-brunns polypropylen med 25 μm ultrahög molekylvikt polyetenmembran) på toppen av det 96-djupa brunnsblocket. Tryck ner filterplattan för att fästa spetsarna i parafilmen för att försegla filterplattan från det 96-brunns djupa blocket. Överför 50 μL förjämfört 50% Ni-NTA hartsslam till varje brunn på filterplattan. Förfarande för testuttryck Placera den frysta cellupphängningen (steg 3.1.15) som finns i 24-brunnsblock i ett vattenbad på RT i 5-10 min och skaka sedan vid 450 varv/min i 20 minuter. Centrifugera 24-brunnsblocken på 3 275 x g i 15 minuter. Använd en flerkanalspipett, överför de rensade lysena till en filterplatta som innehåller 50 μL förjämvikt 50% Ni-NTA-hartsslam (steg 3.2.1.4) och försegla filterplattan med en 96-brunns lockmatta (96-brunnslockmatta, för användning med kvadratbrunn, 2 ml).OBS: Använd några gummiband för att hålla ihop bindningsblocket under inkubations- och centrifugeringssteg. Placera det säkrade bindningsblocket i 45-60 min i en rotator i ett kallt rum för att inkubera rensade lysater med Ni-NTA-harts. Lyft försiktigt filterplattan efter inkubationen och ta bort parafilmskiktet från ytan på det 96 djupa brunnsblocket (steg 3.2.1.1). Placera tillbaka filterplattan ovanpå det 96 djupa brunnsblocket och snurra ner det säkrade bindningsblocket i 2 min vid 235 x g. Tvättbindning Ni-NTA harts 2x med 2 ml tvättbuffert bestående av 25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol och 15 mM imidazol. Snurra ner blocket med tvättbuffert varje gång i 5 min vid 235 x g för att säkerställa fullständig borttagning av restvätska. Överför filterplattan ovanpå PCR-plattan med 96 brunnar som innehåller 10 μL 4x lastfärg. Tillsätt 40 μL elueringsbuffert (25 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 5% glycerol, 500 mM imidazol) till varje brunn på filterplattan och inkubera i 5 min. Snurra ner blocket för att eluera proteiner i 96-brunns PCR-plattan vid 235 x g i 10 min. Försegla 96-brunns PCR-plattan med högtemperaturbeständig kranplatta och värm vid 98 °C i 3 min. Ladda 15 μL eluterade proteinprover i standard Laemmli-buffert på 4-20% SDS-PAGE-gel bredvid proteinstegen och kör gelén med standardkörningsbuffert som innehåller SDS. Färga gelén med Coomassie blå och de-stain med vatten. Analysera testuttryckets resultat för att identifiera de bästa uttryckskonstruktionerna för storskalig produktion. 4. Preparat av de baculovirusinfekterade insektscellerna (SCBIIC) för proteinproduktion 4 dagar före den planerade produktionstiden, dela exponentiellt växande Sf9 celler till en slutlig celltäthet på 2 x 106 celler/ mL i 125 ml / 250 mL / 500 mL Erlenmeyer glasskakkolvar med bafflar i 50 mL / 100 mL / 200 mL insektsserumfritt medium som innehåller 1% (v/ v) slutlig antibiotika-antimykotisk. Tillsätt 0,150 ml / 0,300 ml / 0,6 ml lämpliga P2-virus, inkubera infekterade celler vid 165 varv/min på en orbital shaker med en tums slag och vid en lägre temperatur på 25 °C för att sakta ner celldelningen. Vid 4 dagar efter infektion, kontrollera celler under ett mikroskop för SOI och fortsätt att producera om cellens livskraft som verifierad med Trypan Blue-fläck är nära 70-75%. 5. Sf9-cellberedningar för storskalig proteinproduktion 4 dagar före den schemalagda produktionstiden, beräkna den önskade volymen av Sf9-celler för storskalig proteinproduktion. Frö 2 L exponentiellt växande Sf9-celler i Insektsserumfritt medium till en celltäthet på 1 x 106 celler /ml i 2,8 L Fernbachskakkolvar. Inkubera kolvar vid 27 °C med skakningar inställda vid 150 varv/min.OBS: För att förhindra bakteriell kontaminering i Sf9-cellkulturen, använd gentamicin till en slutlig koncentration på 10 μg/ml eller penicillin/streptomycin till 50 U/ml respektive 50 μg/ml. 6. Infektion av Sf9-cellerna med SCBIIS för storskalig proteinproduktion Dela 2 L eller 4 L exponentiellt växande Sf9-celler i Insect Serum-Free Medium till en slutlig celltäthet på 4 x 106 celler/ml i 2,5 L Tunair shake-flaskor eller 5 L reagensflaskor. Tillsätt 10-12 ml/L av den baculovirusinfekterade insektscellskulturen (SCBIIC). Inkubera den infekterade kulturen hos Sf9-celler på en skakapparat med 145 varv/min vid den lägre temperaturen på 25 °C (för att sakta ner celldelningen) i 72-96 timmar. Vid 72 h efter infektion, kontrollera celler under ett mikroskop för SOI och bedöma cellens livskraft. Vanligtvis, efter ca 72 h efter infektion, sjunker livskraften hos Sf9-celler till 70%-75% (mätt med Trypan Blue-fläck). Skörda infekterade Sf9-celler i en 1 L polypropylenflaska genom centrifugering vid 900 x g i 15 min vid 4 °C. Återanvänd cellpelleten som samlats in från 1 L av produktionscellskulturen med 20-25 ml 1x PBS genom att försiktigt virvla och överföra till 50 ml koniska rör. Snurra ner cellfjädringen vid 900 x g i 15 min och kassera PBS-lösningen. Återanvänd den tvättade cellpelleten med 20-25 ml suspensionsbuffert (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% glycerol, 1x proteashämmarcocktail) och blixtfrysning i flytande kväve; förvara vid −80 °C tills reningen.OBS: Reningsförfarandena för prmts har beskrivits i detalj i SGC publicerad papper6.

Representative Results

En översikt över BEVS-protokollet beskrivs i figur 1. Flera uttryckskonstruktioner av PRMTs, inklusive full längd, domäner och trunkerade fragment, genererades vid Structural Genomics Consortium (SGC, Toronto) enligt interna strategier med ett försök att öka framgångsgraden för att identifiera lösliga och stabila proteiner med en relativt hög uttrycksnivå7,9. Intresserade läsare uppmuntras att granska SGC: s definitioner och metodik för att utforma ett “fragment” som segmentet i gensekvensen som ingår i en uttrycksklon, “domän” som en PFAM-kommenterad strukturell domän och “konstruera” som fragmentet klonat i ett uttryck vektor, som alla har beskrivits i detalj i en tidigarepublikation 7. Uttryck konstruktioner av PRMTs presenteras i detta protokoll är för produktion av polyhistidin-märkta proteiner klonas i pFBOH-MHL vektor, som är ett derivat av pFastBac1 vektor. I figur 4presenterar vi SDS-PAGE-analys av de hismärkta lösliga konstruktionerna av PRMT1, 2, 4-9 renade från pellets som samlats in efter 4 ml produktion i Sf9-celler (steg 3.1.4). Full längd (FL) PRMT1 och PRMT9 presenteras inte i denna gel, eftersom FL PRMT1 har producerats från E. coli, och FL PRMT9 som produceras från BEVS har renats av Flag-tag6. De trunkerade konstruktionerna av PRMT1, FL PRMT4 och alla PRMT8-konstruktioner visar ett relativt högt utbyte, men proteinelektriat innehåller fraktioner av samrenade föroreningar. Dessa konstruktioner kräver ytterligare optimering av reningsprotokollen. Det krävs därför ytterligare metoder för att förbättra renheten hos dessa proteiner från uppskalning av produktioner, såsom en minskning av mängden nickelpärlor i inkubationsstadiet med ett förtydligat lysat. En ökning av imidazolkoncentrationerna i tvättbuffertarna. klyvning av His-tag med TEV protease, följt av tillämpning på en Ni-affinity harts; och ytterligare reningssteg såsom storleksuteslutning och jonutbyteskromatografi. Konstruktionerna av PRMT2 visar betydligt lägre utbyte jämfört med andra proteiner och PRMT2-protein i full längd tillsammans med ett starkt föroreningsband. Uppskalningsproduktion och två steg av rening, såsom IMAC och storleksuteslutning, bekräftade en låg uttrycksnivå för denna konstruktion tillsammans med den ihållande förekomsten av det samrenande föroreningsmedlet för FL-proteinet. Rena proteiner har erhållits för PRMT5-komplexet som produceras och renas med sin obligatoriska bindande partner, MEP50. Den trunkerade konstruktionen av PRMT9 har nästan två eller tre gånger lägre uttrycksnivå, nära 1,5 mg/L, jämfört med andra PRMTs. De rekombinanta viruslagren i denna konstruktion har dock använts för uppskalning av produktion, diffractingkristaller erhölls och strukturen löstes för detta protein tillsammans med PRMT4, 6 och 7 (Figur 5). För uppskalningsproduktionerna användes motsvarande P2-virus för att infektera suspensionskulturen hos Sf9-insektsceller. Detta steg genererar 50/100/200 ml baculovirusinfekterade celler som innehåller infekterade celler och P3-virus i supernaten. För den storskaliga proteinproduktionen odlades 2 L Sf9-celler i var och en av 2,8 L Fernbachskakkolvar vid 150 varv/min, 27 °C (figur 6). På produktionsdagen var 2 L Sf9-celler (cellens livskraft > 97%) i 2,5 L Tunair skakflaskor eller 4 L i 5 L reagensflaskor späddes till en celltäthet på 4 x 106/ml. Dessa celler smittades direkt med 10-12 ml/L suspension kultur av baculovirus-infekterade insekt celler och inkuberade vid en sänkt temperatur av 25 °C, vid 145 rpm. Infektion i produktionspartiet direkt med en suspensionskultur av baculovirusinfekterade insektsceller minskade avsevärt mödosamma och tidskrävande steg i virusvolymförstärkning, exklusive extra hantering av de infekterade cellerna, och undvek minskning av titer och virusnedbrytning. Underhåll av SF9-cellkultur och uppskalning har gjorts i kulturkärlen med hög fyllvolym för att anta en storskalig proteinproduktion i ett parti (figur 6). Prmt 4, 5 i full längd (i komplext med MEP50), 6, 7 och 9 proteiner som framställts från baculovirusmedling produktionsplattformen har använts för kinetisk karakterisering och inhibitorföreningsscreening vid SGC6. Kristallstrukturer löstes och deponerades i Protein Data Bank (PDB) för de full längd eller trunkerade formerna av proteinerna PRMT 4, 6, 7 och 9 med olika kemiska sonder och hämmare. Uttrycksplasmider för dessa PRMTs deponerades till Addgene plasmid-arkivet (Addgene är en distribuerande partner till SGC, https://www.addgene.org/) och är tillgängliga för forskarsamhället (Figur 5). Bild 1: Schematisk översikt över stegen i baculovirusuttrycksprocessen Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 2: Baculovirus Infekterade och oinfekterade Sf9-celler. Tecken på infektion är strukturella förändringar i insektscellerna, såsom en 25-50% ökning av celldiametern, förstorade cellkärnor, jämnt rundad form, förlust av spridning och vidhäftning av odlingsskålens yta, liksom en minskning av cellens livskraft. Vit skala bar 200 μm. De tecken på infektion som presenteras här är desamma för de transfekterade cellerna med hjälp av både transfection reagenser, JetPrime och X-tremeGene 9. Det särskilda exemplet som visas är för JetPrime transfection reagens. A)Oinfekterade Sf9-celler som en kontroll. B)Baculovirusinfekterade Sf9-celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Figur 3:Bindningsplatta för snabb rening av testuttrycksproteiner. Se text för mer information, steg 3.2.1-2 Klicka här för att se en större version av den här figuren. Figur 4: Screeningresultat för proteinuttryck. Protein uttryck screening resultat av baculovirus medierade protein produktion i 4 ml Sf9 suspension kultur infekterad med motsvarande P1 rekombinanta virus för olika PRMTs och PRMT5-MEP50 komplexa. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Figur 5: Sammanfattning av uttryckskonstruktioner för PRMT4, 6, 7 och 9 som används för kristallstrukturstudier vid Structural Genomics Consortium, Toronto (SGC). Kristallstrukturerna löstes och deponerades i Protein Data Bank (PDB) för hela längden eller trunkerade former av proteiner PRMT 4, 6, 7 och 9 med olika kemiska sonder och hämmare. Uttrycksplasmider för dessa PRMTs deponerades till Addgene plasmid-arkivet och är tillgängliga för forskarsamhället (Addgene är en distribuerande partner till SGC, https://www.addgene.org/). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren. Figur 6: Underhåll av insektsceller och proteinproduktion i de olika odlingskärlen: (A) 2,8 L Fernbachkolv för cellunderhåll och proteinproduktion. Användningen av 72% fyllningsvolym ökar genomströmningshastigheten med 2,5 gånger i en skakningsplattform. B)Skakflaskor från Tunair (endast 9 flaskor av 10 presenteras på denna bild) och reagensflaskor med en 80- procentig påfyllningsvolym ökar drastiskt skakplattformens produktionskapacitet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Discussion

En av fördelarna med BEVS i insektsceller är förmågan hos maskinerna för postöversättningsmodifiering för att möjliggöra mer komplexa modifieringar som fosforylering, myristoylering och glykosylering. Tillsammans med den mycket effektiva vikningen av däggdjursproteiner underlättar dessa modifieringar stora mängder modifierat och vikt protein som lämpar sig för fysiologiskt relevanta nedströmsexperiment¹⁶.

Här beskrev vi detaljerade protokoll av BEVS betonar kritiska element för framgångsrik uttryck screening av flera konstruktioner av PRMT proteiner och storskalig PRMT proteinproduktion i Baculovirus uttryck plattform: 1) Användningen av regelbundna, justerbara och programmerbara flerkanaliga pipetter för att överföra de biologiska materialen mellan 24- och 96 – väl cell kulturplattor och block i stadierna av bacmid DNA och virus generation; En samling rekombinanta virus, förstärkning av virusvolymer av rekombinanta virus och beredning av proteinuttrycksscreeningsblocken. 2) Högpresterande och kostnadseffektiva transfection reagenser för generering av rekombinanta virus. 3) Suspensionskultur av baculovirusinfekterade insektsceller (SCBIIC) för storskalig proteinproduktion. 4) Användning av högfyllningsvolym 2,8 L Fernbachskakflaskor för att upprätthålla Sf9-suspensionskulturen och 2,5 L Tunair-skakflaskor och 5 L reagensflaskor för storskalig proteinproduktion.

Särskilda överväganden och motiveringar för omvandlings- och transfection-stegen.
Även om ett kommersiellt protokoll rekommenderar att man använder 100 μL kompetenta celler för en omvandling^14,är omvandlingseffektiviteten hos kommersiella DH10Bac E. coli-kompetenta celler så hög som 1 x 10⁸ cfu / μg DNA, så vi använder bara 4 μL. Detta är tillräckligt för varje transformant för att få isolerade vita rekombinanta kolonier för bacmid DNA-isoleringen. Vidhäftande Sf9 celler i 24-brunn transfection plattan såddes med en celltäthet på 2 x 10⁵ /mL i 0,5 mL serumfria insektsmedier. Denna volym är tillräcklig för att säkerställa jämn täckning av brunnens arbetsyta. Samtidigt späder det inte ut transfectionblandningen för mycket, vilket förbättrar transfectioneffektiviteten. Transfection reagenser är giftfria för Sf9-cellerna, och medieutbyte är inte nödvändigt. I stället för en medieändring tillsätts ytterligare 1,5 ml media som innehåller 10 % (v/v) FBS i transfektionsplattan vid 4-5 timmar efter transfection-tid för att underlätta celltillväxt. Transfection effektiviteten hos båda transfection reagenser är hög. Ändå, med X-tremeGene 9, visas tecknen på infektion i de transfekterade cellerna (figur 2) 10-12 h tidigare än med JetPrime reagens, så vi väljer mellan dessa reagenser beroende på arbetsschemat för nästa steg i protokollen, vilket ger viss flexibilitet i den övergripande processen.

Screening av proteintestuttryck kan ställas in med P2-virus om mängden av de ursprungliga rekombinanta virusen, som samlats in från transfektplattan och märkts som P1, är en begränsande faktor att använda för proteinuttrycksscreeningen.

Överväganden när man går från små till stora kulturvolymer.
Historiskt sett trodde man att optimal celltillväxt kräver ett högt luftutrymme i upphängningskulturen av Sf9-cellunderhåll och uppskalning av produktioner. Men 2014 rapporterades det att högt luftrum i kulturfartyg är mindre kritiskt än man tidigare trott¹⁷. Ett kulturkärl som inrättats med hjälp av lämpligt justerad skakningshastighet till skakplattformens omloppskastning kommer att ge tillräcklig syreöverföring även i högfyllningsvolymupphängningskulturen genom att skapa och underhålla små luftbubblor under en längre tid. Med detta tillvägagångssätt kan kommersiellt tillgängliga insektsceller odlas med en högre skakningshastighet inom ett normalt intervall av cellernas fördubblingstid utan att offra hög cell livskraft.

För sex år sedan började vi alltså öka upphängningskulturen i en skakkolv under cellunderhållet och införde en annan typ av odlingskärl för proteinproduktion samtidigt som vi justerade och övervakade skakningsförhållandena (figur 6). För att fastställa optimala förhållanden i dessa odlingskärl övervakade vi Sf9-cellkulturparametrarna som celldubblingstid tillsammans med cellens livskraft, storlek och form, aggregeringstillstånd och cellernas smittsamhet.

Till exempel, för Sf9-cellunderhåll, i 2,8 L Fernbach-skakkolverna, odlar vi 2 L istället för 0,8 L av Sf9-suspensionscellerna som skakar vid 150 varv/min vid 27 °C och cellens livskraft är för det mesta nära 99%, med jämnt formade friska delningsceller. För uppskalning av produktionen infekterar vi 4 L celler i 5 L reagensflaskor som skakar i hög hastighet som 145 varv/min vid en sänkt temperatur på 25 °C. De vanligaste inkubatorerna med inbyggd skakplattform kan rymma 6 x 2,8 L skakflaskor eller 6 x 5 L reagensflaskor, eller 10 x 2,5 L Tunair shake-flaskor. Således är kapaciteten hos den enda skakplattformen, om vi fyller Fernbachs skakflaskor och reagensflaskor till 1/3 jämfört med kärlens höga fyllningsvolym, 4,8 L jämfört med 12 L med hjälp av 2,8 L Fernbach skakflaskor och 10 L mot 24 L med 5 L reagensflaskor (Figur 6). Underhåll av suspensionsceller och uppskalning av produktionen i kulturkärlen med hög fyllvolym har hjälpt oss att övervinna begränsningarna i produktionsvolymerna och anta en storskalig plattform. Detta är därför mycket användbart för laboratorier utan tillgång till bioreaktorer och/eller begränsat utrymme i produktionspipelinerna.

Detta protokoll skulle lätt kunna anpassas för produktion och rening av proteinkonstruktioner med olika affinitetstaggar genom att använda lämpliga hartser och modifiera reningsbuffertar som har beskrivits i SGC publicerad^{i kapitel 6} för de flaggmärkta fullängdsproteinerna PRMT4, 7, 9 och det hansmärkta PRMT5-MEP50-komplexet och PRMT6. Även om vi beskriver ett BEVS-protokoll för PRMT-familjen av proteiner, kan samma tillvägagångssätt tillämpas på alla andra proteinfamiljer.

Materials

2.8L Nalgene  Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,	Nalgene	29171-854	For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells
24-Well Blocks RB	Qiagen	19583	For incubation of  4ml of suspension  Sf9 cells  for protein  expression screening
4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul	Biorad	5671095	For SDS-PAGe analysis of the purified proteins
50ml Reagent Reservoir	Celltreat Scientific Products	229290	Reservoir used for diluted transfection reagent  and Sf9 cells suspension
96-well cap mat, for use with square well, 2 mL	Greiner Bio-One	381080	Used to cover 96 well block
96 well PCR plate	Eppendorf	30129300
Bacto agar	BD	214010	For LB-agar selection paltes
Airpore Tape Sheets	Qiagen	19571	To cover 24 well blocks for protein expression screening
Allega X-15R Centrifuge	Beckman Coulter	392932
Antibiotic Antimycotic (100x)	Gibco	15240112
Bacmid DNA	in-house	non-catalog item	Bacmid DNA for baculovirus production
Bluo-Gal, 1g	Thermo Fisher	15519028
Beckman JLA 8.1000
Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile	Eppendorf	30722116	Tissue  culture treated plate
Cell Resuspension Solution 0.5 L	Millipore Sigma	LSKCRS500	For Bacmid DNA extraction
Cell Lysis Solution 0.5 L	Millipore Sigma	LSKCLS500	For Bacmid DNA extraction
CELLSTAR  Tissue Culture Plates, 96 well	Greiner Bio-One	655180	For transfection mix
ClipTip 1250, filter reload, sterile	ThermoFisher Scientific	94420818	Tips for  programmable and adjustable multichannel pipette
dNTP Mix (25 mM each)	Thermo Fisher Scientific	R1121
E1-ClipTip  Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL	ThermoFisher Scientific	4672090BT	Programmable and adjustable multichannel pipette
E4  XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL	Ranin	LTS EA6-300XLS	Ranin adjustable multichannel pipette
Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane	Agilent	201005-100	For protein purification in expression screening
Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L	IBI Scientific	SS-6003C	For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells
Gentamicin 10x10ml	BioShop	15750078
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Wisent Biocenter	080-450
I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L	Wisent Biocenter	301-045-LL	Serum free insect cells growth medium
InstantBlue, Ultrafast Protein Stain	Expedeon Protein Solutions	ISB1L-1L	For protein gel (SDS-PAGE) staining
Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5%	BioShop	IPT001.100
JetPRIME Transfection Reagent  Provided with  jetPRIME buffer	POLYPLUS TRANSFECTION Inc	114-01	For Sf9 cells transfection to generate baculovirus
Kanamycin Monosulfate	BioShop	KAN201.100
Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro&	Sigma	L3022-1KG
Masterblock 96 deep well 2.4mL	Greiner Bio-One	780285-FD	Used in the transformation and expression screening procedures
Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml	Thermo Fisher	10361012	Competent cells for bacmid DNA generation
mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL	Sartorius	Sartorius 725240	12 channel pipette
Neutralization Solution, 0.5 L	Millipore Sigma	LSKNS0500	For bacmid DNA extraction
New Brunswick  Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in)	Eppendorf	M1282-0004	Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30250	For protein purification
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	LS15140122
PYREX  Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  500ml	Pyrex	4444-500	For  suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  125ml	Pyrex	4444-125	For suspension culture of Sf9 cells
PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning  250ml	Pyrex	4444-250	For suspension culture of Sf9 cells
RedSafe Nucleic Acid Staining Solution	Froggabio	21141
RNase A, 0.9 mL	Millipore Sigma	LSKPMRN30	For suspension buffer for bacmid DNA extraction
Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads	MP Biomedicals	115000550	For  spread  of bacterial  cells across the surface of an agar plate.
RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips)	Ranin	30389253	Tips for ranin multichannel pipette
S.O.C. Medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian	cytivalifesciences	SH3039602	Addition to the serum free medim for  the transfected cells
Sf9 cells	Thermo Fisher	12659017	Insect cells
Sfx-Insect Cell Culture Media	Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)	SH3027802	Serum free insect cells growth medium
Tape Pad	Qiagen	19570	Tape Pad
Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units	New England Biolabs	M0267L
Tetracycline Hcl	BioShop	TET701.10
Trypan Blue 0.4% Solution	Gibco	15250061	For  assessment of cell viability
VITLAB  Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L	VITLAB	V100889	For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells
VWR  Digital Mini Incubator	VWR	10055-006	Incubator for adherent Sf9 cells
VWR  Incubating Microplate Shaker	VWR	97043-606	Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks
VWR Petri Dishes	VWR	CA73370-037
X-tremeGene 9 DNA  Transfection Reagent  1.0 M	Roche	6365787001	For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus