Summary

Протеомный профиль EPS-Urine через FASP пищеварение и независимый анализ данных

Published: May 08, 2021
doi:

Summary

Здесь мы представляем оптимизированный протокол пищеварения на фильтре с подробной информацией о следующем: переваривание белка, пептидная очистка и независимый анализ приобретения данных. Эта стратегия применяется к анализу выраженных секреций простаты-мочи и позволяет высокий охват протеом и низкое отсутствующей стоимости этикетки свободного профилирования мочевыводящих протеом.

Abstract

Протокол выборки с помощью фильтра (FASP) широко используется для подготовки образца протеомика, поскольку позволяет концентрировать разбавленные образцы и совместим с широким спектром моющих средств. Рабочие процессы протеомики снизу вверх, такие как FASP, все больше полагаются на методы LC-MS/MS, выполняемые в режиме независимого анализа данных (DIA), метод сканирования, который позволяет глубокое покрытие протеома и низкую частоту недостающих значений.

В этом отчете мы предоставим подробную информацию о рабочем процессе, который сочетает в себе протокол FASP, двойной шаг очистки StageTip и LC-MS/MS в режиме DIA для отображения мочевыводящих путей. В качестве образцов мы проанализировали выраженные секреции простаты (EPS)-моча, образец, собранный после цифрового ректального экзамена (DRE), который представляет интерес в исследованиях обнаружения биомаркеров рака простаты.

Introduction

Постоянная эволюция протеомных технологий обещает оказать значительное влияние на диагностику заболеваний и прогнозирование реакции на лечение путем предоставления карт высокого разрешения ключевых молекулярных эффекторов, присутствующих в самых разнообразных образцах, таких как ткани и биофлюиды. С аналитической точки зрения, моча предлагает ряд преимуществ, таких как простота сбора и основные стабильности протеома по отношению к другим биофлюидов1. Протеомный анализ мочи представляет особый интерес в исследованиях по открытию биомаркеров на урологических раковых заболеваниях, так как позволяет неинвазивный отбор проб в непосредственной близости оттканей,представляющих интерес 2 . В частности, образец, который кажется перспективным для изучения патологий, связанных спростатой,– это EPS-urine3,4 (т.е. образец мочи, собранный после цифрового ректального экзамена (DRE).). Эта последняя операция до сбора проб обогащает мочу специфическими белками простаты. EPS-моча является хорошим кандидатом для расследования расстройств, связанныхс предстательной железы 5 в том числе рака предстательной железы (PCa), так как через DRE, белки, выделяется опухоль может быть вылил в образец мочи, увеличивая вероятность обнаружения рака ткани конкретных белков.

Решающую роль в выявлении и количественной оценке потенциальных биомаркеров белка играет масс-спектрометрия (МС). За последние два десятилетия протоколы на основе MS для протеомного анализа позволили постоянно растущее количество белков, которые будут обнаружены в одном LC-MS / MS перспективе благодаря непрерывным улучшениям в MS приборов и в программном обеспечении анализаданных 6.

MS основе протеомной подготовки образца обычно включает в себя энзиматический пищеварения белковой смеси, которые могут быть достигнуты с помощью широкого спектра протоколов, таких как: в растворе пищеварения, MStern blotting7, подвеска захвата (S-ловушка)8, твердой фазы расширенной подготовки образца (SP3)9, in-StageTipпищеварения 10 и фильтрованной подготовки образца (FASP)11. Все протоколы могут быть использованы для протеомии мочевыводящих путей, даже если результаты могут варьироваться в зависимости от количества выявленных белков и пептидов и с точкизрения воспроизводимости 12.

В этой работе наше внимание было сосредоточено на анализе ЭПС-мочи протоколом ФАСП. Протокол FASP был первоначально разработан для анализа белков, извлеченных из тканей и клеточных культур, но затем его использование было расширено до анализа других типов образцов, таких какмоча 13. Что касается простого пищеварения в растворе FASP является более гибкимпротеомный подход 14, так как путем достижения эффективного удаления моющих средств и других загрязняющих веществ, таких как соли из белковой смеси до энзиматическогопищеварения 15, это позволяет выбор оптимальных условий солубилизации белка. Кроме того, еще одной характеристикой ФАСП является то, что она обеспечивает средства концентрации проб. Это представляет особый интерес для протеомного анализа мочевыводящих путей, поскольку позволяет начать с относительно больших объемов выборки (сотни микролитров). В свете потенциала протокола FASP, несколько исследований сосредоточили внимание на автоматизации рабочего процесса, с целью снижения экспериментальной изменчивости и обработки повышенного числа образцов параллельно16.

В нашем рабочем процессе за FASP следует приобретение LC-MS/MS в независимом от данных анализе (DIA), который обеспечивает высокий охват протеом, хорошую количественную точность и низкую частоту недостающих значений. Подход DIA является чувствительным методом, при котором все ионы выбираются для событий MS/MS, напротив того, что происходит в зависимом от данных анализе (DDA), где фрагментированы только ионы с наибольшей интенсивностью. Масс-спектрометр, работающий в режиме DIA, выполняет циклы сканирования с различной шириной изоляции, охватывающей весь диапазон прекурсоров m/z. Такой подход позволяет воспроизводить большое количество пептидов за единицу времени, обеспечивая протеомический снимок образца17. Кроме того, данные, генерируемые DIA имеют еще одну интересную характеристику: возможность заднего анализа18. Данные DIA являются более сложными, чем данные, полученные DDA, потому что MS / MS спектра в DIA в результате совместной изоляции нескольких ионов-прекурсоров в каждом м / z окно19. Разобщание композитных спектров MS/MS в различные и специфические пептидные сигналы достигается с помощью двух фундаментальных элементов: спектральной библиотеки и специального программного обеспечения для анализа данных. Спектральная библиотека генерируется в результате эксперимента, зависящего от данных, обычно включающего пептидную фракционирование для максимального охвата протеом, который содержит список из тысяч экспериментально определяемых ионов-прекурсоров и спектра MS/MS пептидов, обнаруживаемых в рассмотренном образце. Программное обеспечение для анализа данных, вместо этого, использует информацию, содержащуюся в спектральной библиотеке, для интерпретации данных DIA путем генерации конкретных извлеченных ионных хроматограмм, которые позволяют обнаружение пептидов и количественной оценки. В то время как анализ данных DIA без библиотек теперь осуществим, библиотечная DIA по-прежнему обеспечивает лучшие результаты с точки зрения охватаproteome 20.

Протокол подготовки образца здесь описан(рисунок 1) состоит из следующих шагов: шаг центрифугации (для удаления клеточного мусора), fasP пищеварения, Очистка StageTip21, количественная оценка белков и анализ DIA. Этот протокол был разработан для анализа ЭПС-мочи в контексте открытия биомаркера рака простаты, но он может быть применен к протеомическому анализу любого образца мочи.

Protocol

Исследование было одобрено Институциональным этическим комитетом Университета Магна Граесия в Катансаро, RP 41/2018. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов, зачисленных в исследование. 1. Пример подготовки Центрифуга EPS-мочи в пределах 2 ч сбора при 2100 х г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT). Храните супернатант при -80 градусов по Цельсию до его использования. 2. Образец оттаивания Перенесите образец с -80 градусов по Цельсию на -20 градусов по Цельсию за день до пищеварения. Перед обработкой проб перенесите образец на 15-20 минут при 4 градусов по Цельсию, а затем на RT. 3. Подготовка реагентов к FASP В тот же день приготовьте следующие решения: буфер мочевины, 50 мМ иодоацетамида (IAA) в буфере мочевины, 50 мм триэтиламмония бикарбоната и 500 мМ дитиотрейтол (DTT). Подготовка буфера мочевины (мочевина 8 M, 100 мМ Tris-HCl pH 8): для 10 мл, вес 4800 мг мочевины и растворить его в соответствующем количестве воды HPLC после добавления 1 мл 1 M Tris pH 8. Для каждого образца требуется объем в 800 мкл мочевины. Приготовьте 500 мМ дитиотрейтол (DTT): растворите 38,5 мг ДЛТ в 500 мкл воды HPLC. Для каждого образца требуется 66,7 МКЛ ДЛТ. Подготовка 50 мММ IAA в буфере мочевины: растворить 9,25 мг IAA в 1 мл буфера мочевины. Для каждого образца требуется 50 МКЛ IAA. Подготовка 50 мМ триэтиламмония бикарбоната (TEAB). Добавьте 150 л 1 M TEAB к 2,85 мл воды HPLC. Для каждого образца требуется 460 МКЛ TEAB. Подготовь решение трипсина (100 нг/Л) в воде HPLC. Это решение можно хранить при -80 градусов по Цельсию и оттаивать непосредственно перед использованием. Для каждого образца требуется 2 йл (200 нг). 4. Переваривание белка ФАСП Разбавить 500 л каждого образца EPS-мочи с 66,7 л 10% (w/v) додекилового сульфата натрия (SDS), 66,7 л 500 мМ ДЛ и 33,3 л 1 M Tris pH 8 для раствора белков и уменьшения дисульфидных связей. Инкубировать 10 минут при 95 градусов по Цельсию с нежной тряской. Добавьте 300 МКЛ разбавленного образца ЭПС-мочи на блок фильтра (10 кДа) и центрифугу при 14 000 х г в течение 20 минут. Добавьте 200 мкл буфера мочевины к фильтру и центрифуге при 14 000 х г в течение 15 минут. Повторите этот шаг, а затем отбросьте поток через. Добавьте 50 мкл раствора IAA и центрифуги при 6000 х г в течение 25 минут. Добавьте 200 МКЛ буфера мочевины и центрифуги при 14 000 х г в течение 20 минут. Повторите этот шаг, а затем отбросьте поток через. Добавьте 200 мкл буфера триэтиламмония триэтиламмония (TEAB) и центрифугу при 14 000 х г в течение 20 минут. Повторите этот шаг. Перенесите блок фильтра в новую трубку коллекции. Добавьте 60 мкл буфера 50 мМ TEAB и 200 нг трипсина и инкубировать образец в термомешере при 37 градусах Цельсия за ночь.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать испарения образца во время ночной инкубации, оберните каждый фильтр единицы с слоем алюминиевой фольги, а затем слой парафильма. После инкубации трипсина добавьте 140 мл воды и центрифуг в флаконе на 14 000 х г в течение 25 минут, чтобы собрать объем дайджеста (180-200 МКЛ). 5. Реагент подготовка к очистке SCX Подготовка 1 мл мытья 1 (0,5% фамической кислоты (FA) и 20% ацетонитрила (ACN)) следующим образом: добавить 50 йл 10% FA и 200 йл 100% ACN до 750 йл воды HLPC. Для каждого образца, 100 йл мыть 1 необходимы. Подготовка 1,5 мл мытья 2 (0,5% FA и 80% ACN) следующим образом: добавить 75 л 10% FA и 1,2 мл 100% ACN до 225 л воды HPLC. Для каждого образца требуется 190 МКЛ мытья 2. Подготовь 100 л раствора элутирования (ацетат аммония мММ (АА) и 20% ACN): добавьте 25 л 2 М АА и 20 л 100% ACN до 55 л воды HPLC. Подготовка StageTips следующим образом. Упакуйте наконечник пипетки из 200 йл слоем смолы SCX с помощью тупой иглы шприца (калибр 16). Вставьте StageTip в крышку микроцентрифуга, которая ранее была проколота для размещения микроколумна. Соберите крышку на микроцентрифуг 2 мл, из которого была удалена оригинальная крышка. Только что собранное устройство для центробежки micro-SPE должно поместиться в центрифугу скамейки. Так как перфорированные крышки утомительно готовить, они могут быть использованы несколько раз. 6. Очистка SCX Разбавить 30 йл каждого образца до 120 йл с помощью мытья 2. Состояние StageTip, добавив 50 йл мыть 1 на вершине смолы и центрифуги на 400 х г в течение 2 минут. Поскольку устойчивость потока зависит от того, насколько сильно смола извлечения была упакована в кончик пипетки, скорость центрифуги, возможно, потребуется скорректировать, чтобы получить скорость потока 20-30 йл/мин. Старайтесь не оставлять кончик сухим во время загрузки и мытья образца. Эквилибруата StageTip с 50 йл мыть 2 и центрифуги на 400 х г в течение 2 минут. Загрузите разбавленный образец (120 йл) с использованием более низкой скорости вращения. Вымойте StageTip с 50 йл мыть 2 и центрифуги на 400 х г в течение 2 минут. Повторите с 50 йл мытья 1.ПРИМЕЧАНИЕ: После этой стирки смола должна быть полностью сухой. Elute пептидная смесь с 7 йл раствора элуата (500 мМ аммония ацетата (АА) и 20% ACN) медленно, используя более низкую скорость спина. Добавьте 27 л 0,1% FA, чтобы разбавить АА и получить образец для предварительной инъекции LC-MS/MS. Окончательное разбавление до 34 МКЛ приведет к соотношению объема между мочой и пептидным раствором 1 МКЛ очищенного дайджеста, что соответствует 1 МКЛ исходного образца мочи). 7. Белковая количественная оценка по внешнему стандарту с использованием анализа DDA(рисунок 2) Определите количество белка в образцах путем введения 2 л полученного пептидного дайджеста в LC-MS/MS и интерполируя полученную общую пептидную область с кривой калибровки, построенной следующим образом: Подготовь пять различных растворов для переваривания HeLa (1 нг/йл, 2,5 нг/йл, 7,5 нг/йл, 25 нг/ДЛ, 75 нг/йл) с использованием дайджестного запаса HeLa (100 мкг/ОЛ). Ввись каждый раствор Hela в дубликат (2 йл). Установите метод LC-MS/MS. Введите 2 МКЛ из пяти пептидных смесей HeLa и отдельных пептидов через линейный градиент 75 минут со скоростью потока 230 нл/минута на 15 см, 75 мкм колонки, упакованной с 3 мкм C18 частиц кремнезема. Используйте бинарный градиент, образовавшийся в мобильной фазе А (0,1% FA, 2% ACN) и мобильной фазе B (0,1% FA и 80% ACN). Выполняем градиент elution, увеличивая содержание мобильной фазы B с 6% до 42% за 60 минут и с 42% до 100% за дополнительные 8 минут. Поддерживайте в течение 5 минут 100% B, а затем вернуться к 0% B в течение двух минут. Работайте в режиме DDA по методу топ-12 и установите полный диапазон сканирования MS на уровне 350-1800 м/з,разрешение 70 000, цель ACG 1e6 и максимальное время впрыска 50 мс. Установите массовое окно для изоляции ионов прекурсоров на уровне 1,6 м/з,разрешение 35 000, цель ACG 1e5, максимальное время впрыска 120 мс, фрагментация HCD при 25 NCE (нормализованная энергия столкновения) и динамическое исключение 15 секунд. Анализ необработанных файлов с помощью Sequest в качестве поисковой системы, и HUMAN Uniprot Полная последовательность белка в качестве базы данных. В экспериментах, представленных здесь, база данных была загружена в марте 2016 года и содержала 42.013 последовательностей. Используйте следующие настройки: MS толерантность 15 промилле, MS / MS толерантность 0,02 Da, трипсин в качестве фермента, установив два пропущенных сайтов расщепления. В качестве статических модификаций установите карбамидометилирование лизина, серина, трионина, тирозина (57,021 евро) и окисление метионинов в качестве динамических модификаций и карбамидометилирования цистесинов ( 57,021 евро). Используйте отключку ложной скорости обнаружения (FDR) для идентификации пептидов и белков до 0,01 и отфильтруемой перколатором. Рассчитайте пиковую область для всех пептидных сигналов MS1. Рассчитайте общую площадь пептидов. Введите 2 л пептидных смесей, полученных из образцов EPS-мочи, используя тот же метод LC-MS/MS, используемый для образцов HeLa, и проанализируйте необработанный файл, используя те же параметры, что и для обработки данных HeLa. Рассчитать общую интенсивность пептидных сигналов, подводя итоги площади всех выявленных пептидов и интерполировать внешнюю стандартную кривую. Это обеспечит приемлемую оценку количества пептида, присутствуют в дайджесте белка EPS-мочи. 8. Подготовка реагентов к протоколу C18 StageTip Подготовь 500 л раствора А (0,1% трифтороацептной кислоты (TFA), 50% ACN): добавьте 250 л 100% ACN и 10 МКЛ 5% TFA до 240 л воды HPLC. Подготовка 2 мл раствора B (0,1% TFA): добавить 40 л 5% TFA до 1960 л воды HPLC. Подготовь 100 л раствора элутирования (0,1% FA, 50% ACN): добавьте 1 МЛ 10% FA и 50 МКЛ 100% ACN до 49 л воды HPLC. Подготовьтесь к StageTips, как описано ранее. В этом случае используются диски извлечения C18. 9. Протокол SCX/C18 StageTip ПРИМЕЧАНИЕ: Очистить EPS-моча дайджесты C18 StageTip протокол для удаления солей. Начните с 2 мкг пептидов (как количественно предварительной инъекции). Разбавить раствор дайджеста 4 раза в мытье 2 SCX и продолжить, как описано выше (в разделе “SCX очистки”). Elute пептидная смесь с 7 МКЛ раствора элуата (500 мМ ацетата аммония (АА) и 20% ACN) медленно, используя более низкую скорость вращения (5 йл/мин скорость потока). Кислота SCX eluate с 150 йл 0,1% трифтороацептической кислоты (TFA) для достижения рН ниже 3 и концентрации органического растворителя ниже 5%. Состояние C18 StageTip с 50 йл раствора А и центрифуги на 400 х г в течение 2 минут. Эквилибрировать C18 StageTip с 50 мл раствора B и центрифуги при 400 x g в течение 2 минут. Загрузите образец на кончике сцены медленно, используя более низкую скорость вращения. Вымойте C18 StageTip с 50 йл раствора B и центрифуги. Медленно elute пептидной смеси с 10 йл раствора элюции с использованием более низкой скорости спина. Высушите элуат (10 МКЛ) при 30 градусах Цельсия в вакуумной центрифуге в течение 3 минут. Добавьте 47 л 0,1% FA. Ожидаемая концентрация пептида будет 40 нг/л. Анализ LC-MS/MS в режиме DIA. 10. Анализ DIA(рисунок 3) nanoLC разделение: Отделить пептидную смесь с помощью линейного градиента 140 минут при скорости потока 230 нл/мин на 15 см, 75 мкм ID колонки упакованы с 3 мкм C18 частиц кремнезема. Выполните градиент elution на скорости 230 nL/minute потока и увеличьте содержание мобильной фазы B с 3% до 25% за 90 минут, затем с 25% до 40% за 30 минут и, наконец, с 40% до 100% за 8 минут. Через 10 минут при 100% B, уравночные столбец с мобильной фазы А в течение 15 минут. Масс-спектрометрические параметры: выполнить анализ DIA с помощью метода, используя следующий цикл сканирования: i) полное сканирование MS событие с разрешением 17500 (цель AGC 1e6, максимальное время впрыска 50 мс) с последующим (ii) 20 окнами шириной 20 м/z, начиная с м/z 350, (ii) 5 окон при ширине изоляции 50 м/z и (iv) 1 окна на ширине изоляции 200 м/z, заканчивая диапазон сканирования DIA на 1200 м/z. Выполните сканирование DIA с разрешением 35 000 (цель AGC 5e5, максимальное время инъекции 120 мс и 25 NCE). 11. Высокий рН отменил фракционирование фазы C18 для генерации библиотек ПРИМЕЧАНИЕ: Бассейн EPS-мочи репрезентативных образцов в количестве выше 10 мкг для того, чтобы построить зависящие от данных библиотеки для анализа DIA по следующей процедуре: Подкисляйте пептидную смесь (11 мкг) на 0,2% от TFA и загружайте полученное раствор на C18 StageTip, упакованный с двумя слоями дисков экстракции, чтобы обеспечить более высокую емкость. Мы оценили грузоподъемность одного микро-диска (от иглы шприца 16 калибра) в диапазоне 5-10 мкг. Состояние и равноуливная стационарная фаза, как уже описано для очистки C18. Проведение пептидной фракционности поэтапной элюцией (n’10) от высокой рН обратной фазы C18 с использованием элюционных растворов, содержащих 0,2% гидроксида аммония, 10 мМ ГТЭБ, и увеличение концентраций в/в ACN (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%). Проанализируйте 10 фракций с использованием тех же хроматографических параметров метода DIA. Работайте масс-спектрометр в режиме DDA с использованием параметров, ранее принятых для предварительного анализа (см. “Белковая квантификация по внешнему стандарту с использованием анализа DDA”). 12. Анализ данных Создать спектральную библиотеку путем импорта результатов идентификации белка, полученных в результате экспериментов DDA LC-MS/MS высокоотвернёной фракционации фазы C18 в программном обеспечении, посвященном анализу DIA. Установите минимальное и максимальное количество ионов фрагментов, используемых для идентификации и количественной оценки, до 3 и 6, соответственно. Фильтр полученных результатов по цене 0,01 евро. Импортируют необработанные файлы DIA и связывают с каждым необработанным файлом один и тот же файл FASTA, используемый для создания спектральной библиотеки. Установите минимальное и максимальное количество уникальных пептидов, используемых для количественной оценки белка, до 1 и 10, соответственно. Рассчитайте интенсивность для каждого белка, подводя итоги фрагмента ионные пиковые области. Создать матрицу с интенсивностью количественных белков в каждом образце.

Representative Results

Этот протокол протеомного анализа мочевыводящих путей включает в себя следующие шаги: пищеварение FASP, оценка количества белка с помощью внешней стандартной калибровки, двойная очистка StageTip (SCX и C18),и анализ LC-MS/MS в режиме DIA. После переваривания белка, предварительные инъекции выполняются после StageTip SCX очистки полученных пептидов. Необработанные файлы LC-MS/MS обрабатываются для получения количества идентифицированных пептидов, количества идентифицированных белков и площади обнаруженных пептидов. Общая площадь, полученная путем подведения итогов всех выявленных пептидов, используется для оценки содержания белка с помощью интерполяции по внешнему стандарту: дайджест белка HeLa, вводимый в пяти различных количествах (2, 5, 15, 50, 150 нг соответственно). Количество белка для шести образцов, проанализированных в этом исследовании, варьировалось от образца к образцу, показывая среднее значение 78 нг/йл. После оценки белка, 2 мкг переваренных белков из каждого образца очищаются последовательными SCX и C18 StageTip до анализа DIA. Спектральная библиотека для поиска данных DIA создается после обратной фракционации с высокой рН и анализа DDA LC-MS/MS репрезентативной выборки (например, пула образцов). Используя описанные выше параметры, мы определили и количественно определили в совокупности 2387 белковых групп в шести рассмотренных образцах ЭПС-мочи(Дополнительная таблица 1 и рисунок 4). Для того, чтобы оценить с качественной точки зрения актуальность списка выявленных и количественных белков, полученную матрицу сравнили со списком из 624 белков, ранее выявленных в direct- EPS22, образце, собранном в более инвазивной процедуре, которая оказалась источником интересных биомаркеров рака предстательной железы. В общей сложности 508 из 624 белков были успешно обнаружены нашим протоколом FASP/DIA по EPS-моче. Рисунок 1: Протеомный рабочий процесс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Представление нашего экспериментального дизайна для количественной оценки белка на основе внешнего стандарта (HeLa дайджест). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Ключевые этапы анализа DIA: i) разработка спектральной библиотеки с помощью высокой рН обратной фазы фракционации и анализа DDA, ii) анализа выборки с использованием подхода DIA, (iii) анализа данных Спектронавтом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Рейтинговый участок для обнаруженных EPS-мочевых белков. Несколько выбранных хитов помечены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Дополнительная таблица 1: Репрезентативная таблица количественных белков в шести образцах ЭПС-мочи в Спектронавте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Discussion

В этой работе представлена стратегия анализа образцов ЭПС-мочи. Протокол FASP является идеальным выбором для протеомии мочевыводящих путей, поскольку он позволяет концентрации образца до энзиматической пищеварения. В самом деле, используя этот рабочий процесс, несколько сотен микролитров мочи могут быть загружены на один фильтр и обработаны. Кроме того, пищеварение на фильтре обеспечивает относительную свободу в выборе условий денатурации. В нашей работе денатурация белка достигается путем разбавления образцов мочи в буфере, содержащем Трис, СДС и ДДТ (окончательная концентрация: 50 мМ Трис, 1% SDS, 50 мМ ДТТ). Белки эффективно денатурированы сразу после оттаивания образца, чтобы избежать нежелательной деградации активными протеасами. Первоначальный протокол FASP был улучшен за счет увеличения объема моет со 100 йл до 200 йл. Таким образом, достигается лучшее удаление остатков, особенно моющих средств из фильтра.

После энзиматичного пищеварения, оценки белка по внешнему стандарту с использованием быстрого LC-MS/MS, зависящий от данных метод выполняется перед последними этапами протокола, которые включают двойную очистку StageTip и анализ LC-MS/MS в режиме DIA, на равных исходном материале для всех образцов (2 мкг).

Универсальность FASP связана с подходом DIA, чувствительным методом, обеспечивающим небольшое количество недостающих значений17. В нашей работе было выявлено и количественно выявлено 2387 белков, что позволило получить подробный протеомный профиль EPS-мочи. Идентификация и количественная оценка 2387 белков стала возможной благодаря генерации богатой спектральной библиотеки, полученной с помощью обратной фракционации пептидов с высоким рН, и нашим методом DIA, направленным на широкий диапазон прекурсоров м/з. Этот рабочий процесс определил более 80% белков, ранее найденных в прямом анализе EPS, демонстрируя, что значительная часть ПРОТЕом EPS-мочеиспускания действительно получена из выраженных простатических секретов, таким образом, является богатым источником специфических белковпростаты ткани 26.

В заключение, наш экспериментальный дизайн пары универсальность FASP с чувствительностью DIA для того, чтобы получить богатую карту мочевыводящих протеом. Эта стратегия рекомендуется для анализа образцов ЭПС-мочи, но ее использование может быть распространено на протеомию мочевыводящих путей в целом или даже на другие типы образцов.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана MIUR (Министро Университет Ricerca, PRIN 2017 в MG) и POR Калабрии FESR 2014-2020, действие 1.2.2, “INNOPROST”.

Materials

1 M Tris HCL pH 8.0 Lonza 51238
2-iodoacetamide for synthesis Merck 8047440100
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade VWR 83640.290
Ammonium acetate Fluka 9690
ammonium hydroxide solution Sigma 30501
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water Merck 318612-500ML
Dithiothreitol Amresco 0281-25G
Empore Cation 47mm Extraction Disks Microcolumn 2251
Empore Disk C18 Varian 12145004
Formic acid optima Fisher Scientific A117-50
Hela Protein Digest Standard Fisher Scientific 88329
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane MERCK MRCPRT010
sodium dodecyl sulfate solution Merck 71736-500ML
Thiethylammonium bicarbonate buffer Merck T7408-100ML
trifluoroacetic acid Riedel-de Haën 34957
Trypsin from porcine pancreas Merck T6567-1MG
Urea Merck U6504-500G
Water HPLC gradient grade Fisher Scientific W/0106/17
Proteome Discoverer 1,4 Thermo Fisher Scientific
Spectronaut 14.0 Biognosys

References

  1. Hüttenhain, R., Soste, M., Selevsek, N., et al. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics. Sci Transl Med. 4 (142), 10 (2013).
  2. Roobol, M. J., Carlsson, S. V. Risk stratification in prostate cancer screening. Nature Reviews Urology. 10 (1), 38-48 (2013).
  3. Principe, S., et al. Identification of prostate-enriched proteins by in-depth proteomic analyses of expressed prostatic secretions in urine. Journal of Proteome Research. 11 (4), 2386-2396 (2012).
  4. Kim, Y., et al. Targeted proteomics identifies liquid-biopsy signatures for extracapsular prostate cancer. Nature Communications. 7, 1-10 (2016).
  5. Drake, R. R., et al. Clinical collection and protein properties of expressed prostatic secretions as a source for biomarkers of prostatic disease. Journal of Proteomics. 72 (6), 907-917 (2009).
  6. Macklin, A., Khan, S., Kislinger, T. Recent advances in mass spectrometry based clinical proteomics: Applications to cancer research. Clinical Proteomics. 17 (1), 1-25 (2020).
  7. Berger, S. T., et al. MStern blotting-high throughput polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane-based proteomic sample preparation for 96-well plates. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (10), 2814-2823 (2015).
  8. Zougman, A., Selby, P. J., Banks, R. E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis. Proteomics. 14 (9), 1006 (2014).
  9. Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10 (10), 757 (2014).
  10. Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11 (3), 319-324 (2014).
  11. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).
  12. Ding, H., et al. Urine Proteomics: Evaluation of Different Sample Preparation Workflows for Quantitative, Reproducible, and Improved Depth of Analysis. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1857-1862 (2020).
  13. Zhao, M., et al. A comprehensive analysis and annotation of human normal urinary proteome. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  14. Wiśniewski, J. R. Quantitative Evaluation of Filter Aided Sample Preparation (FASP) and Multienzyme Digestion FASP Protocols. Analytical Chemistry. 88 (10), 5438-5443 (2016).
  15. Wiśniewski, J. R., Zielinska, D. F., Mann, M. Comparison of ultrafiltration units for proteomic and N-glycoproteomic analysis by the filter-aided sample preparation method. Analytical Biochemistry. 410 (2), 307-309 (2011).
  16. Yu, Y., et al. Urine sample preparation in 96-well filter plates for quantitative clinical proteomics. Analytical Chemistry. 86 (11), (2014).
  17. Gillet, L. C., et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: A new concept for consistent and accurate proteome analysis. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (6), 1-17 (2012).
  18. Liu, Y., Hüttenhain, R., Collins, B., Aebersold, R. Mass spectrometric protein maps for biomarker discovery and clinical research. Expert Review of Molecular Diagnostics. 13 (8), 811-825 (2013).
  19. Gallien, S., Duriez, E., Demeure, K., Domon, B. Selectivity of LC-MS/MS analysis: Implication for proteomics experiments. Journal of Proteomics. 81, 148-158 (2013).
  20. Muntel, J., et al. Advancing Urinary Protein Biomarker Discovery by Data-Independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4752-4762 (2015).
  21. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  22. Kim, Y., et al. Identification of Differentially Expressed Proteins in Direct Expressed Prostatic Secretions of Men with Organ-confined Versus Extracapsular Prostate Cancer. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1870-1884 (2012).
  23. Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular and Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
  24. Thongboonkerd, V. Practical points in urinary proteomics. Journal of Proteome Research. 6 (10), 3881-3890 (2007).
  25. Konvalinka, A., Scholey, J. W., Diamandis, E. P. Searching for new biomarkers of renal diseases through proteomics. Clinical Chemistry. 58 (2), 353-365 (2012).
  26. Drake, R. R., et al. In-Depth Proteomic Analyses of Direct Expressed Prostatic Secretions. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2109-2116 (2010).

Play Video

Cite This Article
Prestagiacomo, L. E., Gabriele, C., Morelli, P., Rota, M. A., Alba, S., Cuda, G., Damiano, R., Gaspari, M. Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62512, doi:10.3791/62512 (2021).

View Video