이 프로토콜은 결정성 나노셀룰로오스(CNC)/아가로즈 복합 하이드로겔 생체재료 잉크를 마우스 골수 유래 마스트 세포와 함께 세포 표면 수용체의 세포 생존성 및 표현성 발현, 키트(CD117) 및 고친화도 이에 수용체(FcθRI)의 생체 적합성을 신속하게 평가하는 방법을 강조한다.
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이 논문에서
요약
초록
3차원(3D) 바이오프린팅은 패턴으로 증착되는 하이드로겔 기반 복합체(또는 생체재료 잉크)를 활용하여 어떤 세포가 증착되는지기판으로 형성한다. 많은 생체 재료 잉크는 잠재적으로 1 차 세포에 세포 독성이 될 수 있기 때문에, 비용이 많이 드는 3D 조직 엔지니어링 프로세스에서 그들의 활용 하기 전에 이러한 하이드로겔 복합체의 생체 적합성을 결정 하는 데 필요한. 바이오프린팅을 포함한 일부 3D 배양 방법은 세포가 3D 매트릭스에 내장되어 기계적 손상을 유도하지 않고 생존력 및 바이오마커 발현의 변화를 추출하고 분석하기 어렵게 만듭니다. 이 프로토콜은 개념증명으로서, 결정성 나노셀룰로오스(CNC) 내장아가로즈 복합체의 생체 적합성을 평가하는 방법으로, 24웰 배양 시스템으로 제조되었으며, 마우스 골수 유래 마스트 세포(BMMC)는 세포 생존가능성 및 바이오마커 발현에 대한 유동 세포측정 분석법을 사용하여 한다.
CNC/아가로즈/D-매니톨 매트릭스에 18h의 노출 후, BMMC 생존력은 프로피듐 요오드(PI) 투과성에 의해 측정된 바와 같이 변경되지 않았습니다. 그러나, CNC/아가로즈/D-mannitol 기판상에서 배양된 BMMCs는 고친화 IgE 수용체(FcθRI) 및 줄기 세포 인자 수용체(Kit; CD117), 이는 바이오잉크 복합체에서 CNC의 양에 의존하는 것으로 보이지 는 않지만. BMMC의 생존가능성은 또한 3D 압출 바이오 프린터를 사용하여 피릴라 나노 셀룰로오스 (FNC)와 나트륨 알기네이트로 구성된 상업용 생체 재료 잉크에서 제조 된 하이드로겔 스캐폴드에 시간 과정 노출 에 따라 평가되었다. 6-48h의 기간 동안, FNC/alginate 기판은 유동 세포측정및 미세titer 분석(XTT 및 젖산 탈수소효소)에 의해 결정된 바와 같이 BMMC의 생존가능성에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 이 프로토콜은 마스트 세포와의 포스트 인쇄 시드를 위한 3D 스캐폴드로 유틸리티에 대한 후보 생체 재료 잉크의 생화학적 호환성을 신속하게 선별하는 효율적인 방법을 설명합니다.
서론
최근 3D 배양 시스템과 3D 바이오프린팅에 대한 관심은 하이드로겔 과 하이드로겔 복합재에 주목하고 있습니다. 이러한 복합체는 점성 아직 다공성 생물미약제의 역할을 하며 생물학적 조직에 필적하는 중량별 최대 99%의 수분 함량으로 구성될 수 있다1,2,3. 하이드로겔 복합재의 이러한 특징은 생존력과 기능에 영향을 미치지 않으면서 세포의 성장을 허용합니다. 이러한 복합체중 하나는 하이드로겔 복합재, 세포 스캐폴드, 2차원(2D) 및 체외세포 배양에서 보강재료로 사용되어 온 결정성 나노셀룰로오스(CNC)이다4,5. 대부분의 경우, CNC로 구성된 행렬은 인간 각막 상피 세포6, 장 상피 세포7, 인간 골수 유래 중간엽 줄기 세포8 또는 뉴런과 같은 세포9에 지나치게 세포독성이 없습니다. 그러나, 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 대사 활동 및....
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프로토콜
참고: 본 프로토콜은 마우스 골수의 분리와 마우스 골수 유래 마스트 세포(BMMC)의 분화, (2) CNC/아가로즈/D-mannitol 하이드로겔기질의 제조, 기판에 대한 BMMC의 24웰 시스템 및 배양, (3) CNC/아가로즈/D-mannitol 하이드로겔 기판으로부터 BMMC제거 및 유동 세포측정을 이용한 생존가능성 및 바이오마커 발현의 분석, (4) 상용 피브릴라 나노셀룰로오스(FNC)/나트륨 알기네이트 복합 생체 재료 잉크로부터 의 3D 바이오프린팅및 FNC/나트륨 알기네이트 하이드로겔 스캐폴드및 유동 세포측정, XTT, 락테이트 탈수소(LDH)를 이용한 생존가능성 분석(LDH)의 BMMC 배양
1. BMMC 문화의 세대
참고: 마우스는 이소플루란 마취 다음 CO2 질식에 의해 안락사되었다. 경골과 대퇴골은 고립되었고, 골수 전체를 수확했습니다. 모든 동물 연구는 알버타 대학의 건강 과학 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받아 캐나다 동물 관리 지침 및 정책에 대한 캐나다 위원회에 따라 수행되었습니다.
- 표 1에 나열된 보충제를 표시된 최종 농도에 추가하여 완전한 RPMI-1640 배양 배지를 준비하십시오. NaOH....
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결과
성공적인 생체 재료 잉크 또는 배양 기판의 가장 중요한 특성 중 하나는 생체 적합성입니다. 주로, 기판은 세포 사멸을 유도해서는 안됩니다. 세포 생존력과 괴사를 정량화하는 몇 가지 미세량 계 및 유극성 방법이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 하이드로겔 매트릭스 내에 포함된 세포를 분석할 수 없습니다. 이 프로토콜에서, 상기 언급한 제한은 BMMC를 하이드로겔 기질 또는 생체 인쇄 스캐폴드에 시드함으로써 회피된다. 특정 인큐베이션 기간(이 연구에서 6-48h)이 발생한 후, BMMC는 하이드로겔 기판 또는 생체 인쇄 스캐폴드의 기계적 중단 또는 가수분해 없이 마이크로파이프팅에 의해 쉽게 수확되며, 이는 그렇지 않으면 세포에 물리적 손상을 입힐 수 있다. 그런 다음 BMMC의 생존가능성은 유동 세포측정법을 통해 PI 투과성 방법을 사용하여 빠르게 분석된다. PI는 DNA16의 염기 쌍 사이 를 상호 작용하는 경우에만 그대로 세포막 과 형광을 가진 실행 가능한 세포에서 제외되는 막 불굴의 염.......
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토론
3D 생체 mimetic 조직의 제조는 세포 외 매트릭스의 구성 요소를 모방하는 바이오 잉크의 성공적인 합병을 필요로하며, 세포 구성 요소 (들)와 함께 생체 내 조직의 생리적 유사체를 생성합니다. 이것은 생리적인 생물역학 조직을 제조할 때 1 차적인 세포의 사용을 필요로 하고, 세포를 변형시키지 않습니다. 그러나 비만 세포와 같은 1차 면역학적 세포는 특히 생잉크 매트릭스 자체에 의해 유도될 수 있는 세포독성 효과 및 현상적 변화에 취약하며, 이는 바람직하지 않다. 따라서, 마스트 세포의 생존가능성 및 표현형(표면 수용체 발현)에 대한 후보 생체물질 잉크의 효과를 신속하게 평가하는 능력은 특히 바이오잉크 매트릭스 내에 내장된 다른 세포 유형을 포함하는 복잡한 조직의 3D 바이오프린팅 이전에 매우 유리하며, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요된다.
이 프로토콜의 접근은 BMMC를 배양하는 것을 포함합니다, 1 차성 마스트 세포의 예는, 미리 형성된 후보 하이.......
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공개 사항
이 작품은 캐나다 국립 연구 위원회와 앨버타 혁신에 의해 지원되었다.
감사의 글
CNC/아가로즈/D-mannitol 매트릭스를 준비할 때 CNC와 켄 해리스, 조재영에게 기술적 조언을 해주신 알버타 이노베이트에게 감사드립니다. 우리는 또한 벤 호프만, 헤더 윈첼과 니콜 디아만타이드의 기술적 조언과 INKREDIBLE + 3D 바이오 프린터의 설정 및 교정에 대한 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| 아르메니아 햄스터 IgG Isotype Control, APC (clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-메르캅토에탄올 | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 나트륨염(NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5mL 주사기(Luer-Lok 팁) | BD | 309646 | |
| PrecisionGlide 바늘 26G x 1/2인치 | BD | 305111 | |
| BioLite 24웰 멀티디쉬 | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 웰 멀티디쉬 | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 플라스크 통풍 | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 마우스 | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL 카트리지) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | ||
| CELLINK 빈 카트리지 3cc(엔드 캡 및 팁 캡 포함) | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| PC용 CELLINK HeartWare | CELLINK LLC | 버전 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D 바이오프린터 | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK 멸균 표준 원추형 바이오프린팅 노즐 22G | CELLINK LLC | ||
| CELLINK 멸균 표준 원뿔형 바이오프린팅 노즐 25G | CELLINK LLC | ||
| CELLINK 멸균 표준 원뿔형 바이오프린팅 노즐 27G | CELLINK LLC | ||
| 세포 증식 키트 II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| 코닝 코스타 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX 유세포 분석기 | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL 폴리스티렌 코니컬 튜브, 멸균 | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL 폴리스티렌 코니컬 튜브, 멸균 | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha 단클론 항체, APC (클론: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| 소 태아 혈청(FBS), 적격, 열 비활성화된 | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | 버전 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | 버전 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacyometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES 나트륨 염 | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| 리튬 L-젖산염 | 시그마 Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM 비필수 아미노산 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-메톡시-5-메틸페나지늄 메틸 설페이트(MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| 마이크로튜브(1.7 mL 투명) | Axygen | MCT-175-C | |
| 마이크로튜브(2.0 mL 투명) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic(MilliQ 초순수 생산용) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene 주사기 필터(0.2mm PES, 25mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| 페니실린 스트렙토마이신 100mL(Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, 칼슘/마그네슘 없음, 500mL(Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (클론: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| 재조합 쥐 IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 미디엄 1X + 2.05 mM L-글루타민(HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 웰 라운드 베이스 PS 투명 마이크로 테스트 플레이트(82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| 아지드화나트륨, 500g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| 피루브산 나트륨 (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX 마이크로플레이트 분광 광도계 (유형: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
참고문헌
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.
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재인쇄 및 허가
