Brugen af kunstig intelligens (Ai) til at analysere billeder er ved at opstå som en kraftfuld, mindre forudindtaget og hurtig tilgang sammenlignet med almindeligt anvendte metoder. Her trænede vi Ai til at genkende en cellulær organelle, primær cilier, og analysere egenskaber som længde og farvning intensitet i en streng og reproducerbar måde.
Cilia er mikrotubule baseret cellulære vedhæng, der fungerer som signalering centre for en mangfoldighed af signalering veje i mange pattedyr celletyper. Cilia længde er meget bevaret, stramt reguleret, og varierer mellem forskellige celletyper og væv og har været involveret i direkte at påvirke deres signalkapacitet. For eksempel har cilia vist sig at ændre deres længder som reaktion på aktivering af ciliary G protein-koblede receptorer. Men nøjagtigt og reproducerbar måling af længden af talrige cilier er en tidskrævende og arbejdskrævende procedure. Nuværende tilgange er også fejl og bias tilbøjelige. Kunstig intelligens (Ai) programmer kan udnyttes til at overvinde mange af disse udfordringer på grund af kapaciteter, der tillader assimilering, manipulation og optimering af omfattende datasæt. Her viser vi, at et Ai-modul kan trænes til at genkende cilier i billeder fra både in vivo- og in vitro-prøver. Efter at have brugt den uddannede Ai til at identificere cilier, er vi i stand til at designe og hurtigt udnytte applikationer, der analyserer hundredvis af cilier i en enkelt prøve for længde, fluorescensintensitet og co-lokalisering. Denne upartiske tilgang øgede vores tillid og stringens, når vi sammenligner prøver fra forskellige primære neuronale preps in vitro såvel som på tværs af forskellige hjerneområder inden for et dyr og mellem dyr. Desuden kan denne teknik bruges til pålideligt at analysere cilia dynamik fra enhver celletype og væv i en high-throughput måde på tværs af flere prøver og behandlingsgrupper. I sidste ende vil Ai-baserede tilgange sandsynligvis blive standard, da de fleste områder bevæger sig i retning af mindre partiske og mere reproducerbare tilgange til billedopsamling og -analyse.
Primære cilia er sensoriske organeller, der stikker ud fra de fleste pattedyrscelletyper1,2,3,4. De er generelt ensomme vedhæng, der er afgørende for koordinering af forskellige cellesignaleringsveje ved at integrere ekstracellulære signaler5,6,7. Primær cilier spiller vigtige roller under embryonal udvikling og voksen væv homøostase, og afbrydelse af deres funktion eller morfologi er forbundet med flere genetiske lidelser, som kollektivt kaldes ciliopatier. På grund af cilias næsten allestedsnærværende karakter er ciliopatier forbundet med en bred vifte af kliniske funktioner, der kan påvirke alle organsystemer8,9,10,11,12. I dyremodeller af ciliopatier manifesterer tab af ciliary-struktur eller signalkapacitet sig i flere klinisk relevante fænotyper, herunder hyperfagirelateret fedme3,13,14,15. I mange modelsystemer har ændringer i cilierlængden vist sig at påvirke deres signalkapacitet og funktioner16,17,18,19. Der er dog flere tidskrævende og tekniske udfordringer forbundet med nøjagtigt og reproducerbar vurdering af cilier længde og sammensætning.
Det voksne pattedyrs centralnervesystem (CNS) er en biologisk kontekst, der har udgjort en udfordring for at forstå cilia morfologi og funktion. Mens det ser ud til, at neuroner og celler i hele CNS besidder cilier, på grund af de begrænsede værktøjer og evner til at observere og analysere disse cilier en forståelse af deres funktioner forbliver undvigende20. For eksempel, den prototypiske cilia markør, acetyleret α-tubulin, ikke mærke neuronal cilia20. Vanskeligheden ved at studere disse cilier blev delvist løst med opdagelsen af flere G protein-koblede receptorer (GPCR), signalmaskiner og membran tilknyttede proteiner, der er beriget på membranen af neuronal cilia21,22. Alle disse enkle grundlæggende observationer antyder vigtigheden og mangfoldigheden af CNS-cilier, som hidtil synes uden sidestykke af andre væv. For eksempel kan variation i cilier længde og GPCR lokalisering observeres i hele hjernen, med længder i visse neuronale kerner er forskellige sammenlignet med andre kerner19,23. Tilsvarende viser deres GPCR-indhold og signalmaskiner kompliment mangfoldighed baseret på neuroanatomisk placering og neuronal type2,24,25,26,27,28,29. Disse enkle observationer viser, at pattedyr CNS cilia længde og sammensætning er stramt reguleret, ligesom i model organismer, som Chlamydomonas reinhardtii, men virkningen af disse længde forskelle på cilier funktion, signalering og i sidste ende adfærd er fortsat uklart16,30,31,32.
Nøjagtig måling af cilia længde og sammensætning viser sig at være en teknisk udfordring tilbøjelige til brugerfejl og uigenkaldelighed. I øjeblikket cilier in vivo og in vitro er oftest identificeret ved hjælp af immunofluorescent tilgange, mærkning ciliary proteiner eller cilia-beriget fluorescerende reporter alleler33,34,35. Længden af disse fluorescerende mærkede cilier måles derefter fra et 2-dimensionelt (2D) billede ved hjælp af linjemålingsværktøjer i billedanalyseprogrammer som ImageJ36. Denne proces er ikke kun kedelig og arbejdskrævende, men også tilbøjelig til bias og fejl. De samme forhindringer opstår ved måling af cilia intensiteter, som hjælper med at indikere ændringer i cilier struktur37. For at minimere uoverensstemmelserne i disse typer billedanalyser bliver programmer til kunstig intelligens (Ai) mere udbredte og overkommelige muligheder38.
Ai er udviklingen af computersystemer, der bruger fordelen ved computeralgoritmer og programmering til at udføre opgaver, der normalt ville kræve menneskelig intelligens39. Ai-enheder lærer at opfatte tilbagevendende mønstre, parametre og egenskaber og træffe foranstaltninger for at maksimere oddsene for at skabe vellykkede resultater. Ai er alsidig og kan trænes til at genkende specifikke objekter eller strukturer af interesse, såsom cilier, og derefter programmeres til at køre en række analyser på de identificerede objekter. Derfor kan komplekse billeddata hurtigt og reproducerbar genereres af Ai38. Automatisering og Ai-analyse af optagne billeder vil øge effektiviteten og samtidig begrænse eventuelle menneskelige fejl og bias39. Etablering af en Ai-baseret metode til cilia-identifikation skaber en ensartet måde for alle forskergrupper at analysere og fortolke cilia-data på.
Her bruger vi et Ai-modul til at identificere cilier både in vivo og in vitro på 2D-billeder. Ved hjælp af et sæt prøvebilleder trænes Ai’en til at identificere cilier. Når træningen er færdig, bruges den udpegede Ai til at anvende en binær maske over Ai-identificeret cilier i et billede. De binære filer, der anvendes af Ai er modificerbare, hvis det er nødvendigt, for at sikre, at alle cilier i billederne er korrekt identificeret og ikke-specifik identifikation er elimineret. Efter at have udnyttet Ai til at identificere cilier, specialbygget generelle analyse (GA) programmer bruges til at udføre forskellige analyser såsom måling cilier længde og fluorescens intensitet. De indsamlede data eksporteres til en tabel, der let kan læses, fortolkes og bruges til statistiske analyser (Figur 1). Brugen af automatiseret teknologi og Ai til at identificere cilier og opnå specifikke målinger mellem eksperimentelle grupper vil støtte i fremtidige undersøgelser med henblik på at forstå virkningen af CNS cilia funktion og morfologi på celle-celle kommunikation og adfærd.
Længde- og intensitetsmålinger er almindelige måder, hvorpå primær cilier analyseres, men der er ikke en standardiseret konventionel metode, der anvendes i marken. Identifikation og kvantificering af primær cilier ved hjælp af software som ImageJ er tidskrævende og tilbøjelig til at brugeren bias og fejl. Dette gør det vanskeligt præcist at analysere store datasæt. Her viser vi, at ved hjælp af et Ai-program kan overvinde mange af disse udfordringer, der gør høj gennemløbsanalyse af primær cilier opnåelig. Heri beskriver vi proceduren for træning af et Ai-baseret program til at genkende primær cilier og skitsere de trin, der kræves for at analysere længde og intensitet.
Mens den indledende træning af Ai til at genkende cilier kræver betydelig tid fra brugeren, når den er afsluttet, kan den bruges på ethvert datasæt, der er erhvervet med de samme parametre. Den binære maske, der genereres af Ai, kan ændres, så eventuelle fejl kan rettes. Fejl i cilia-identifikationen skal dog signalere brugeren, at Ai’en skal trænes yderligere med yderligere billeder. En stor fordel ved denne metode er, at Ai kan trænes til at genkende cilier i forskellige prøvetyper i både 2D og 3D. Tidligere analysemetoder, der genereres i laboratorier, har forskelligebegrænsninger,herunder krav om manuel tærskelværdi for identifikation og problemer med at identificere cilier, der er afbildet fra vævssektioner, hvor celletætheden er høj36,46,47. Disse metoder er også specialiseret til cilia analyse, mens analyse ved hjælp af NIS Elements software kan evaluere flere aspekter af billederne samtidigt. Fordi Ai beskrevet her er en del af NIS Elements softwarepakke, billeder erhvervet ved hjælp af et Nikon mikroskop kan let fortsættes igennem til analyse. Billedbehandling med Nikon er dog ikke påkrævet for at bruge denne metode. Uanset det hentede raw datafilformat kan “.tif” filer åbnes af NIS Elements, der kan bruges i Ai.
Denne Ai-applikation inden for NIS Elements er bredt tilgængelig og muligvis allerede en del af billedanalysesoftware i brug af laboratorier, der studerer primær cilier. Med udbredelsen af Ai-teknologi ekspanderende, andre billedbehandling software kan udvide deres analysemuligheder til at omfatte en lignende Ai modul. Anvendelse ai analyse til cilier identifikation kan bruges til flere forskellige aspekter af cilier analyse. Mens vi skitserede metoder til nogle få enkle analyser som længde (figur 2 og 3), intensitet (Figur 4) og colocalization (Figur 5) mere sofistikeret analyse kan føjes til GA3 analyse workflow som i figur 6. I stedet for at måle intensiteten af et fuldstændigtcilium kan forskelle i intensitet inden for et underområde af etcilium f.eks. være af interesse i at vurdere sub-ciliary lokalisering. Forskelle i intensitet i en subregion af et cilium kan indikere, at proteinet akkumuleres ved spidsen eller bunden afciliet, såsom hvordan Gli-proteiner beriges ved spidsen af cilia48. Derudover kan denne Ai-applikation bruges til let at identificere forskelle mellem genotyper eller behandlingsgrupper. Mens vores laboratorium primært bruger denne metode til at analysere cilia afbildet fra hjerne sektioner eller neuronale kulturer, det kan anvendes til billeder erhvervet fra forskellige cellelinjer eller andre vævstyper. Den fleksibilitet af prøvetype, som denne applikation kan anvendes på, gør denne analysemetode værdifuld for mange forskellige grupper, der studerer primær cilier eller enhver diskret organelle, der vurderes, såsom mitokondrier, kerne eller ER.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 til NFB og American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 til RB. Vi takker Rich Gruskin General Manager for Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft og Teresa Mastracci for indsigtsfulde kommentarer til manuskriptet.
Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM | Intel Corporation | W-2123 | Processor used for running NIS Elements. |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments Inc. | – | Ai and GA3 software |
Quadro RTX 4000 Graphics card | NVIDIA Corporation | Quadro RTX 4000 | |
Windows 10 Professional 64-bit | Microsoft Inc. | – | Operating system used for running NIS Elements |
Workstation | HP Development Company, L.P. | HP Z4G4 | Workstation used for running NIS Elements |