Bruken av kunstig intelligens (Ai) for å analysere bilder fremstår som en kraftig, mindre partisk og rask tilnærming sammenlignet med vanlige metoder. Her trente vi Ai til å gjenkjenne en cellulær organell, primær cilia, og analysere egenskaper som lengde og fargingsintensitet på en streng og reproduserbar måte.
Cilia er mikrotubulebaserte cellulære vedlegg som fungerer som signalsentre for et mangfold av signalveier i mange pattedyrcelletyper. Cilia lengde er svært bevart, tett regulert, og varierer mellom ulike celletyper og vev og har vært involvert i direkte innvirkning av deres signalkapasitet. For eksempel har cilia vist seg å endre lengdene som svar på aktivering av ciliary G protein-koblede reseptorer. Men nøyaktig og reprodusert måling av lengdene på mange cilia er en tidkrevende og arbeidsintensiv prosedyre. Nåværende tilnærminger er også feil- og biasutsatte. Kunstig intelligens (Ai) programmer kan brukes til å overvinne mange av disse utfordringene på grunn av evner som tillater assimilering, manipulering og optimalisering av omfattende datasett. Her demonstrerer vi at en Ai-modul kan trenes til å gjenkjenne cilia i bilder fra både in vivo- og in vitro-prøver. Etter å ha brukt den opplærte Ai til å identifisere cilia, er vi i stand til å designe og raskt bruke applikasjoner som analyserer hundrevis av cilia i en enkelt prøve for lengde, fluorescensintensitet og samlokalisering. Denne objektive tilnærmingen økte vår selvtillit og strenghet når vi sammenlignet prøver fra forskjellige primære nevronale preps in vitro så vel som på tvers av forskjellige hjerneregioner i et dyr og mellom dyr. Videre kan denne teknikken brukes til pålitelig å analysere ciliadynamikk fra hvilken som helst celletype og vev på en høy gjennomstrømningsmåte på tvers av flere prøver og behandlingsgrupper. Til syvende og sist vil Ai-baserte tilnærminger sannsynligvis bli standard etter hvert som de fleste felt beveger seg mot mindre partiske og mer reproduserbare tilnærminger for bildeanskaffelse og analyse.
Primær cilia er sensoriske organeller som stikker ut fra de fleste pattedyrcelletyper1,2,3,4. De er generelt ensomme vedlegg som er kritiske for koordinering av ulike cellesignalveier ved å integrere ekstracellulære signaler5,6,7. Primær cilia spiller viktige roller under embryonal utvikling og voksenvev homeostase, og forstyrrelse av deres funksjon eller morfologi er forbundet med flere genetiske lidelser, som kollektivt kalles ciliopatier. På grunn av ciliaens nær allestedsnærværende natur er ciliopatier forbundet med et bredt spekter av kliniske egenskaper som kan påvirke alle organsystemer8,9,10,11,12. I dyremodeller av ciliopatier manifesterer tap av ciliary-struktur eller signalkapasitet i flere klinisk relevante fenotyper, inkludert hyperfagi-assosiert fedme3,13,14,15. I mange modellsystemer har cilia lengdeendringer vist seg å påvirke deres signalkapasitet og funksjoner16,17,18,19. Det er imidlertid flere tidkrevende og tekniske utfordringer knyttet til nøyaktig og reprodusering av cilia lengde og sammensetning.
Det voksne pattedyrets sentralnervesystem (CNS) er en biologisk kontekst som har utgjort en utfordring for å forstå cilia morfologi og funksjon. Mens det ser ut til at nevroner og celler i hele CNS har cilia, på grunn av de begrensede verktøyene og evnene til å observere og analysere disse cilia, forblir en forståelse av deres funksjoner unnvikende20. For eksempel merker den prototypiske ciliamarkøren, acetylert α-tubulin, ikke nevronal cilia20. Vanskeligheten med å studere disse cilia ble delvis løst med oppdagelsen av flere G protein-koblede reseptorer (GPCR), signalmaskiner og membran assosierte proteiner som er beriket på membranen av nevronal cilia21,22. Alle disse enkle grunnleggende observasjonene antyder viktigheten og mangfoldet av CNS cilia, som så langt fremstår uten sidestykke av andre vev. For eksempel kan variasjon i cilia lengde og GPCR lokalisering observeres i hele hjernen, med lengder i visse nevronale kjerner som er forskjellige sammenlignet med andre kjerner19,23. På samme måte viser deres GPCR-innhold og signalmaskiner mangfold basert på nevroanatomisk plassering og nevronal type2,24,25,26,27,28,29. Disse enkle observasjonene viser at pattedyr CNS cilia lengde og sammensetning er tett regulert, akkurat som i modellorganismer, som Chlamydomonas reinhardtii, men virkningen av disse lengdeforskjellene på cilia-funksjon, signalering og til slutt oppførsel forblir uklar16,30,31,32.
Nøyaktig måling av cilia lengde og sammensetning viser seg å være en teknisk utfordring utsatt for brukerfeil og irreproducibility. For tiden er cilia in vivo og in vitro oftest identifisert ved hjelp av immunfluorescerende tilnærminger som merker ciliary proteiner eller cilia-beriket fluorescerende reporter alleler33,34,35. Lengdene på disse fluorescerende kodede cilia måles deretter fra et 2-dimensjonalt (2D) bilde ved hjelp av linjemålingsverktøy i bildeanalyseprogrammer som ImageJ36. Denne prosessen er ikke bare kjedelig og arbeidsintensiv, men også utsatt for fordommer og feil. De samme hindringene oppstår ved måling av cilia-intensiteter, noe som bidrar til å indikere endringer i cilia struktur37. For å minimere inkonsekvensene i denne typen bildeanalyser, blir kunstig intelligens (Ai) -programmer mer utbredte og rimelige alternativer38.
Ai er fremskrittet av datasystemer som bruker fordelen med dataalgoritmer og programmering for å utføre oppgaver som vanligvis krever menneskelig intelligens39. Ai-enheter læres å oppfatte tilbakevendende mønstre, parametere og egenskaper og iverksette tiltak for å maksimere oddsen for å skape vellykkede resultater. Ai er allsidig og kan trenes til å gjenkjenne spesifikke objekter eller strukturer av interesse, for eksempel cilia, og deretter programmeres til å kjøre en rekke analyser på de identifiserte objektene. Derfor kan komplekse bildedata raskt og reproduseres av Ai38. Automatisering og Ai-analyse av innspilte bilder vil øke effektiviteten og effektiviteten samtidig som potensielle menneskelige feil ogskjevheter begrenses. Etablering av en Ai-basert metodikk for ciliaidentifikasjon skaper en konsistent måte for alle forskningsgrupper å analysere og tolke ciliadata på.
Her bruker vi en Ai-modul for å identifisere cilia både in vivo og in vitro på 2D-bilder. Ved hjelp av et sett med prøvebilder er ai opplært til å identifisere cilia. Når opplæringen er fullført, brukes den angitte ai-en til å bruke en binær maske over Ai identifisert cilia i et bilde. Binærfilene som brukes av ai er modifiserbare, om nødvendig, for å sikre at alle cilia i bildene er riktig identifisert og ikke-spesifikk identifikasjon elimineres. Etter å ha brukt Ai til å identifisere cilia, brukes spesialbygde generelle analyseprogrammer (GA) til å utføre forskjellige analyser som måling av cilia lengde og fluorescensintensitet. Dataene som samles inn, eksporteres til en tabell som enkelt kan leses, tolkes og brukes til statistiske analyser (figur 1). Bruk av automatisert teknologi og ai for å identifisere cilia og oppnå spesifikke målinger mellom eksperimentelle grupper vil hjelpe i fremtidige studier med sikte på å forstå effekten av CNS cilia-funksjon og morfologi på cellecellekommunikasjon og atferd.
Lengde- og intensitetsmålinger er vanlige måter primære cilia analyseres på, men det er ikke en standardisert konvensjonell metode som brukes i feltet. Identifisering og kvantifisering av primær cilia ved hjelp av programvare som ImageJ er tidkrevende og utsatt for brukerforskjeller og feil. Dette gjør det vanskelig å analysere store datasett nøyaktig. Her viser vi at bruk av et Ai-program kan overvinne mange av disse utfordringene som gjør høy gjennomstrømningsanalyse av primære cilia oppnåelige. Her beskriver vi prosedyren for opplæring av en Ai-basert applikasjon for å gjenkjenne primære cilia og skissere trinnene som kreves for å analysere lengde og intensitet.
Mens den første opplæringen av Ai for å gjenkjenne cilia krever betydelig tid fra brukeren, når den er fullført, kan den brukes på et hvilket som helst datasett som er anskaffet med de samme parametrene. Den binære masken som genereres av ai er modifiserbar slik at eventuelle feil kan rettes. Feil i ciliaidentifikasjon bør imidlertid signalisere brukeren at Ai-en må trenes videre med flere bilder. En stor fordel med denne metoden er at Ai kan trenes til å gjenkjenne cilia i forskjellige utvalgstyper i både 2D og 3D. Tidligere analysemetoder generert i laboratorier har ulike begrensninger, inkludert å kreve manuell tersklering for identifisering og problemer med å identifisere cilia avbildet fra vevsseksjoner der celletettheten er høy36,46,47. Disse metodene er også spesialisert for cilia analyse mens analyse ved hjelp av NIS Elements programvare kan evaluere flere aspekter av bildene samtidig. Fordi Ai beskrevet her er en del av NIS Elements programvarepakke, kan bilder som er anskaffet ved hjelp av et Nikon-mikroskop enkelt fortsettes gjennom til analyse. Avbildning med Nikon er imidlertid ikke nødvendig for bruk av denne metoden. Uavhengig av det fangede rådatafilformatet, kan “.tif” -filer åpnes av NIS Elements for bruk i Ai.
Denne Ai-applikasjonen i NIS Elements er allment tilgjengelig og muligens allerede en del av bildeanalyseprogramvare som brukes av laboratorier som studerer primære cilia. Når utbredelsen av Ai-teknologi utvides, kan annen bildebehandlingsprogramvare utvide analysealternativene til å omfatte en lignende Ai-modul. Bruk av Ai-analyse på ciliaidentifikasjon kan brukes til flere forskjellige aspekter ved ciliaanalyse. Mens vi skisserte metoder for noen få enkle analyser som lengde (figur 2 og 3), kan intensitet (figur 4) og colokalisering (figur 5) mer sofistikert analyse legges til i GA3-analysearbeidsflyten som i figur 6. For eksempel, i stedet for å måle intensiteten til et komplett cilium, kan forskjeller i intensitet i en underregion av et cilium være av interesse for å vurdere sub-ciliary lokalisering. Forskjeller i intensitet i en underregion av et cilium kan indikere at proteinet akkumuleres på spissen eller bunnen av ciliumet, for eksempel hvordan Gli-proteiner er beriket på spissen av cilia48. I tillegg kan denne Ai-applikasjonen brukes til å enkelt identifisere forskjeller mellom genotyper eller behandlingsgrupper. Mens laboratoriet vårt først og fremst bruker denne metoden til å analysere cilia avbildet fra hjerneseksjoner eller nevronkulturer, kan den brukes på bilder anskaffet fra ulike cellelinjer eller andre vevstyper. Fleksibiliteten til utvalgstype som denne applikasjonen kan brukes på, gjør denne analysemetoden verdifull for mange forskjellige grupper som studerer primær cilia eller en diskret organelle som vurderes som mitokondrier, kjerne eller ER.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases R01 DK114008 til NFB og American Heart Association Fellowship Grant #18PRE34020122 til RB. Vi takker Rich Gruskins daglige leder for Nikon Software, Melissa Bentley, Courtney Haycraft og Teresa Mastracci for innsiktsfulle kommentarer til manuskriptet.
Intel Xeon, 3.6 GHz, 32GB RAM | Intel Corporation | W-2123 | Processor used for running NIS Elements. |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments Inc. | – | Ai and GA3 software |
Quadro RTX 4000 Graphics card | NVIDIA Corporation | Quadro RTX 4000 | |
Windows 10 Professional 64-bit | Microsoft Inc. | – | Operating system used for running NIS Elements |
Workstation | HP Development Company, L.P. | HP Z4G4 | Workstation used for running NIS Elements |