Apple Pulp'da Sitoplazmik Ca2+'yı Fluo-4/AM ile Boyama
Summary
Elma hamuru hücrelerinin izole protoplastları sitoplazmik Ca2+ konsantrasyonu tespit etmek için kalsiyum floresan reaktif ile yüklendi.
Abstract
Sitosoleik Ca2+, bitki gelişiminde önemli bir rol oynar. Kalsiyum görüntüleme sitoplazmada Ca2+ dinamik değişiklikleri tespit etmek için en çok yönlü yöntemdir. Bu çalışmada enzimatik hidroliz ile pulpa hücrelerinin uygulanabilir protoplastlarını elde ettik. İzole protoplastlar 37 °C’de 30 dakika boyunca küçük moleküllü floresan reaktif (Fluo-4/AM) ile inkübe edildi. Floresan problar sitosolik Ca2+’yı başarıyla lekeledi, ancak vakuollerde birikmedi. La3+, bir Ca2 + kanal engelleyici, sitoplazmik floresan yoğunluğunu azalttı. Bu sonuçlar Fluo-4/AM’nin meyve etinde sitosolik Ca2+ değişikliklerini tespit etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Özetle, protoplastları meyvenin et hücrelerinden etkili bir şekilde izole etmek ve pulpa hücrelerinin sitoplazmında küçük moleküllü kalsiyum floresan reaktif yükleyerek Ca2+’yı tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.
Introduction
Ca2+ bitki sinyali transdüksiyonu ve metabolizmasında önemli bir rol oynar1,2. Ayrıca, meyve kalitesi özelliklerini düzenler3,4, sertlik, şeker içeriği ve depolama sırasında fizyolojik bozukluklara duyarlılık dahil5,6. Sitoplazmik Ca2+ sinyal transdüksiyonunda önemli bir rol oynar ve bitki büyümesini ve gelişimini düzenler7. Hücresel kalsiyum homeostaz rahatsızlığı elmalarda acı çukura neden olabilir8, armutlarda kahverengi nokta hastalığı9ve domateslerde göbek çürümesi10, meyve kalitesini etkiler ve ciddi ekonomik kayıplara neden olur3,11. Kalsiyum görüntüleme yeterli mekansal ve zamansal çözünürlüğe sahiptir ve canlı hücrelerde Ca2+ dinamiklerini gözlemlemek için önemli bir yöntemdir12,13.
Şu anda, canlı hücrelerde hücre içi kalsiyum görüntüleme için iki ana yöntem vardır: biri kimyasal küçük moleküler floresan problar14, diğeri ise gen kodlama sensörü (GECI)15,16. Meyve ağaçlarında kararlı bir transgenik sistem kurmanın zorluğu ve daha uzun meyve gelişimi göz önüne alındığında, GECIS meyve Ca2 + floresan görüntüleme için uygun değildir.
Fluo-4/AM gibi küçük moleküllü floresan probların özel bir avantajı vardır: ester formları (hücre geçirgen asetoksimetil ester türevi) transfeksiyona gerek kalmadan canlı hücrelere kolayca toplu olarak yüklenebilir, bu da onu esnek, hızlı ve sitotoksik olmayan17yapar. Fluo-4/AM, Pyrus pyrifolia18 ve Petunia,19 polen tüpüne ve Arabidopsis21’in 20 ve kök saçlarına başarıyla yüklenebilir.
Şu anda, pulpa hücrelerinin kalsiyum floresan boyanma hakkında çok az rapor vardır22. Önemli bir mineral element olarak kalsiyum, elma gibi ağaç meyvelerinin büyümesinde ve kalite kontrolünde kilit rol oynar. Elma ağaçları küresel olarak önemli bir ekonomik tür olarak kabul edilir ve elmalar sağlıklı bir yiyecek olarak kabul edilir23. Bu çalışmada, enzimatik hidroliz yoluyla elma meyve hamurundan uygulanabilir protoplastlar elde ettik ve daha sonra Ca2+tespit etmek için sitoplazmaya küçük moleküllü floresan reaktifler yükledik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada enzimatik hidroliz ile uygulanabilir protoplastlar elde edilmiştir. Bu yöntemin taze elma gerektirdiğini unutmayın. Mevcut protokol, araştırma çalışmalarında kullanılmak üzere çok sayıda protoplastın meyve hamurundan hızlı bir şekilde izole edilmesini sağlar. Bu yöntemin uygulanabilirliği ‘Fuji’ ile sınırlı değildir; ‘Dounan’ ve ‘Honey Crisp’ elma hamurunun protoplastları da aynı protokolle çıkarılabilir (Ek Şekil S4). Enzimolizden sonra protoplast çözelti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Shandong Eyaleti Tarımsal Çeşitliliği İyileştirme Projesi (2019LZGC007) ve Shandong modern tarım endüstrisi teknoloji sisteminin (SDAIT-06-05) Meyve ağacı inovasyon ekibi tarafından desteklendi.
Materials
| 10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
| CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
| Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
| D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
| F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
| FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
| Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
| Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
| Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
| Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |
References
- Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. Fruit calcium: Transport and physiology. Frontiers in Plant Science. 7, 569 (2016).
- Li, J., Yang, H. -. q., Yan, T. -. l., Shu, H. -. r. Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling. Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).
- Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening. Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).
- Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).
- Deell, J. R., Khanizadeh, S., Saad, F., Ferree, D. C. Factors affecting apple fruit firmness–a review. Journal- American Pomological Society. 55 (1), 8-27 (2001).
- Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review. New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).
- Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions. New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).
- Miqueloto, A., et al. Mechanisms regulating fruit calcium content and susceptibility to bitter pit in cultivars of apple. Acta horticulturae. 1194 (1194), 469-474 (2018).
- Kou, X., et al. Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on ‘Huangguan’ pears during cold storage. Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).
- Vinh, T. D., et al. Comparative analysis on blossom-end rot incidence in two tomato cultivars in relation to calcium nutrition and fruit growth. The Horticulture Journal. 87 (1), 97-105 (2018).
- Yamane, T. Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees. Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. CSH Protocols. 2013 (2), 83 (2013).
- Hirabayashi, K., et al. Development of practical red fluorescent probe for cytoplasmic calcium ions with greatly improved cell-membrane permeability. Cell Calcium. 60 (4), 256-265 (2016).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca(2)(+) dynamics. Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Zhao, Y., et al. An expanded palette of genetically encoded Ca(2)(+) indicators. Science. 333 (2), 1888-1891 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca2+-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs. PLoS One. 11, 0152320 (2016).
- Suwińska, A., Wasąg, P., Zakrzewski, P., Lenartowska, M., Lenartowski, R. Calreticulin is required for calcium homeostasis and proper pollen tube tip growth in Petunia. Planta. 245 (5), 909-926 (2017).
- Sun, L., et al. NADK2 positively modulates abscisic acid-induced stomatal closure by affecting accumulation of H2O2, Ca2+ and nitric oxide in Arabidopsis guard cells. Plant Science. 262, 81-90 (2017).
- Niu, Y. F., et al. Magnesium availability regulates the development of root hairs in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. Plant Cell and Environment. 37 (12), 2795-2813 (2014).
- Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica. Horticulture Research. 7, 91 (2020).
- Boyer, J., Liu, R. H. Apple phytochemicals and their health benefits. Nutrition Journal. 3 (1), 5 (2004).
- Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).
- Qu, H., Shang, Z., Zhang, S., Liu, L., Wu, J. Identification of hyperpolarization-activated calcium channels in apical pollen tubes of Pyrus pyrifolia. New Phytologist. 174 (3), 524-536 (2007).
- Hadjantonakis, A. K., Pisano, E., Papaioannou, V. E. Tbx6 regulates left/right patterning in mouse embryos through effects on nodal cilia and perinodal signaling. PLoS One. 3 (6), 2511 (2008).
- DeSimone, J. A., et al. Changes in taste receptor cell [Ca2+]i modulate chorda tympani responses to salty and sour taste stimuli. Journal of Neurophysiology. 108 (12), 3206-3220 (2012).
- Kao, J. P., Harootunian, A. T., Tsien, R. Y. Photochemically generated cytosolic calcium pulses and their detection by fluo-3. Journal of Biological Chemistry. 264 (14), 8179-8184 (1989).
- Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2. Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).
- Li, W., et al. A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium. Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647 (2014).
- Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature. Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).
- Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia. Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).
- Wang, Y., et al. Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs. BMC Plant Biology. 10, 53 (2010).
- Fujimori, T., Jencks, W. P. Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion. Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).
