تم تحميل البروتوبلاستات المعزولة لخلايا لب التفاح بكاشف فلوري للكالسيوم للكشف عن تركيز Ca2+ السيتوبلازمي.
Cytosolic Ca2 + يلعب دورا رئيسيا في تطوير النبات. تصوير الكالسيوم هو الأسلوب الأكثر تنوعا للكشف عن التغيرات الديناميكية في Ca2 + في السيتوبلازم. في هذه الدراسة، حصلنا على بروتوبلاستس قابلة للحياة من خلايا اللب عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. تم احتضان البروتوبلاست المعزول مع كاشف الفلورسنت صغير الجزيء (Fluo-4/AM) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. المسابير الفلورية ملطخة بنجاح cytosolic Ca2 + ولكن لم تتراكم في vacuoles. La3+، مانع قناة Ca2 + ، انخفض كثافة الفلورية السيتوبلازمية. تشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام Fluo-4/AM للكشف عن التغيرات في السيتوسوليك Ca2+ في لحم الفاكهة. باختصار، نقدم طريقة لعزل البروتوبلاست بشكل فعال من خلايا اللحم في الفاكهة والكشف عن Ca2+ عن طريق تحميل كاشف فلوري الكالسيوم صغير الجزيء في السيتوبلازم لخلايا اللب.
Ca2 + يلعب دورا هاما في نقل إشارة النبات والتمثيل الغذائي1،2. علاوة على ذلك ، فإنه ينظم سمات جودة الفاكهة3،4، بما في ذلك صلابة ، محتوى السكر ، والتعرض للاضطرابات الفسيولوجية أثناء التخزين5،6. السيتوبلازمية Ca2 + يلعب دورا هاما في نقل الإشارات وينظم نمو النبات والتنمية7. اضطراب التوازن الكالسيوم الخلوي يمكن أن تحفز حفرة مريرة في التفاح8، مرض بقعة بنية اللون في الكمثرى9، وتعفن السرة في الطماطم10، مما يؤثر على جودة الفاكهة ويسبب خسائر اقتصادية شديدة3،11. التصوير بالكالسيوم لديه ما يكفي من الدقة المكانية والزمنية وهو وسيلة هامةلمراقبة ديناميات Ca 2 + في الخلايا الحية12،13.
في الوقت الحاضر ، هناك طريقتان رئيسيتان لتصوير الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا الحية: واحدة تستخدم مسابير فلورية كيميائية صغيرة جزيئية14، والأخرى هي مستشعر ترميز الجينات (GECI)15،16. نظرا لصعوبة إنشاء نظام معدل وراثيا مستقر في أشجار الفاكهة وتطوير الفاكهة لفترة أطول ، فإن GECIS غير مناسب لتصوير الفاكهة Ca2 + fluorescence.
مسابير الفلورسنت جزيء صغير مثل فلوو-4/AM لها ميزة خاصة: شكلها إستر AM (الخلية نفاذية أستوكسي ميثيل استر مشتق) يمكن بسهولة الجزء الأكبر تحميلها في الخلايا الحية دون الحاجة إلى الترافيكتيون، مما يجعلها مرنة وسريعة وغير سامة للخلايا17. فلوو-4/AM يمكن تحميلها بنجاح في أنبوب حبوب اللقاح من Pyrus pyrifolia18 وبيتونيا،19 وكذلك في خلايا الحراسة20 والشعر الجذر من Arabidopsis21.
في الوقت الحاضر، وهناك تقارير قليلة عن تلطيخ مضان الكالسيوم من خلايا اللب22. كعنصر معدني مهم، يلعب الكالسيوم دورا رئيسيا في نمو ومراقبة جودة ثمار الأشجار مثل التفاح. ومن المسلم به عالميا أشجار التفاح كنوع اقتصادي مهم، والتفاح تعتبر الغذاء الصحي23. في هذه الدراسة، حصلنا على protoplasts قابلة للحياة من لب فاكهة التفاح من خلال التحلل المائي الأنزيمي ومن ثم تحميل الكواشف الفلورية جزيء صغير في السيتوبلازم للكشف عن Ca2 +.
في هذه الدراسة ، تم الحصول على protoplasts قابلة للحياة عن طريق التحلل المائي الأنزيمي. لاحظ أن هذا الأسلوب يتطلب التفاح الطازج. ويسمح هذا البروتوكول بالعزل السريع لعدد كبير من المواد الأولية عن لب الفاكهة لاستخدامها في الدراسات البحثية. ولا يقتصر تطبيق هذه الطريقة على ‘فوجي’؛ بل إن المسألة هي أ…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال مشروع تحسين التنوع الزراعي في مقاطعة شاندونغ (2019LZGC007) وفريق ابتكار شجرة الفاكهة التابع لنظام شاندونغ الحديث لتكنولوجيا الصناعة الزراعية (SDAIT-06-05).
10× phosphate-buffered saline | Solarbio | P1022 | PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4. |
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid | Solarbio | M8010 | Biological buffer |
CaCl2·2H2O | Solarbio | C8370 | Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form. |
Cellulase R-10 | Yakult Honsha | MX7352 | Degrade plant cell walls. |
D-sorbitol | Solarbio | S8090 | It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing. |
F-127 | Thermo Fisher Scientific | P6867 | Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media. |
FDA | Thermo Fisher Scientific | F1303 | FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product. |
Fluo-4/AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser. |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher | EVOS Auto 2 | Observe the fluorescence image. |
Macerozyme R-10 | Yakult Honsha | MX7351 | Degrade plant tissue to separate single cells. |
Tris | Solarbio | T8060 | It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments. |